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碱性磷酸酶Km值的测定,1,1.了解酶的Km值测定原理和方法 2掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测定的原理和方法,【实验目的】,2,在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加，但当底物浓度增大到一定极限时，则反应速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即：,【实验原理】,3,VmaxS V= Km + S 其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度， 当V=Vmax/2时，则Km=s。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶的一种方法,4,将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v1s作图，将各点连线，在横轴截距为-km，据此可算出Km值。 1/V=Km/ VmaxS + 1/ Vmax,5,S,底物浓度与反应速度关系曲线,双倒数曲线,6,本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。其反应式如下： 磷酸苯二钠+H2O AKP OH- 苯酚 苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色） 光密度与颜色，颜色与酚，酚与酶活性成正比，故以1/A 取代1/v 作为纵坐标作图,7,1. 0.04 M(40mM) 磷酸苯二钠溶液（底物液） 2. 0.1 M 碳酸盐缓冲液（pH 10.0） 3. 0.05 mg/ml 碱性磷酸酶溶液（Ap） 4. 0.5 M NaOH 5. 0.3 % 4-氨基安替比林 6. 0.5% 铁氰化钾,【实验试剂】,8,【实验操作】,混匀后37水浴，预温5分钟左右,9,加入酶液后立即混匀（保持37水浴），反应开始。 从加入酶液起计时至下一步 加入碱性溶液停止反应，各管反应时间应准确一致，为15分钟。,10,混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度,11,【实验结果】,1、原始数据,12,以1s为横轴，1OD510为纵轴作图，观察曲线形状；查Km 值,2、作图,13,
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