DNA提取和常见问题分析及对策

DN A 提取和常见问题 分析及对策 主讲人 关 锰 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com DNA简 单介 绍 DNA是遗传信 息 的载体 是最重 要 的生物 信息分子 是分 子 生物学研 究的主 要 对象 为了进行 测序 杂 交和基因 的表达 获得 高 分子量和 高纯度 的D NA是非常重要的 前 提 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com DNA提提 取取 原原 则则 保证D NA结 构的 完整性 纯化后不应存 在 对酶有抑 制作用 的物质 排除有机溶剂 和 金属离子 的污染 蛋白质 多 糖 酚类等 降 低到 最 低 程度 排除其他核酸 分 子的污染 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com DNA提取的提取的 几几 种方法种方法 一 染色体D NA的提取 CTAB法 SDS法 其 它 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com DNA提提 取取 的几的几 种种 方法方法 二 非染色体 DNA的提 取 质粒 DNA的 提 取 碱 裂解 法 煮 沸法 线粒 体 叶绿体 DNA的 提 取 差 速离 心结 合S DS裂解 法 CTAB法 原 理 植 物 DNA提 取 经 典 方 法 CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide 十六 烷基 三甲基溴化铵 是一种阳离子去污剂 可溶解细胞 膜 并与核酸形成复合物 该复合物在高盐溶 液中 0 7mol L NaCl 是可溶的 通 过有机溶剂抽提 去 除蛋白 多糖 酚类等杂质后 加入乙 醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来 注 C TAB溶 液在低 于1 5 时会形成 沉淀析 出 因 此在 将其加入 冰冷 的植物材 料之前 必须预 热 且离心时 温度不 要低于 15 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com CTAB法 流 程 图 植 物 材 料 裂 解 液 异 丙 醇沉 淀 液 氮 研 磨 抽 提 离 心 洗涤 DNA溶 液 细 胞 裂解 上 层 溶 液 干 燥 溶解 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com CTAB中各个组分 的作用 CTAB提 取缓冲 液的经 典配 方 Tris HCl pH8 0 提 供 一 个缓冲 环 境 防 止核 酸 被 破 坏 EDTA螯 合Mg 2 离 子或Mn 2 离子 抑 制D Nase活性 NaCl 提供 一个高 盐环境 使D NP充分 溶解 存在于 液 相中 CTAB溶解细 胞膜 并结合 核酸 使 核酸便 于分离 巯 基 乙醇 是 抗氧 化 剂 有效地 防 止酚 氧 化成 醌 避 免褐变 使 酚容易去 除 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com CTAB提 取 缓 冲液 的 改进 配方 PVP 聚乙烯吡咯烷 酮 是酚的络合物 能与 多酚 形成一种不溶的络合物质 有效去除多酚 减少 DNA中酚的污染 同 时 它也能和多糖结合 有效 去除多糖 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com 除蛋 白质 氯仿 异戊醇抽提 氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相 的分离 异戊醇则有助于消除抽提过程 中 出现的气泡 使用变性剂变性 SDS 异硫氰酸胍等 高盐洗涤 蛋白酶处理 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com 除多 糖 高盐法 用乙醇沉淀时 在待沉淀溶液中加入1 2体积 的5M N aCl 高盐可溶解多糖 用多糖水解酶将多糖降解 在提取缓冲液中加一定量的氯苯 1 2体积 氯苯可以 与多糖的羟基作用 从而去除多糖 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com 除酚 类物质 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂 巯基 乙醇 抗坏血酸 半胱氨酸 二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂 如P VP PEG 聚乙二 醇 它们与 酚类有 较强的亲和力 可防止酚类 与D NA的结合 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com 除盐 离子 70 的乙醇洗涤 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com TE中成分 的作用 TE中的 EDTA能螯和M g2 或Mn 2 离子 抑制D Nase pH值为 8 0 可防止D NA发生酸解 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com 称 取 样品 液 氮研 磨 加入 预热 的 65 CTAB及 巯 基 乙 醇 保 温 1h 期间 不停 的 摇均 吸 取 上清 液 移至 新 的离 心管 中 加 入 等体 积氯 仿 异戊 醇 24 1 轻缓 颠倒 混 匀 10000rpm 10min 取 上 清液 移 至新 的离 心管 中 加 等 体积 氯仿 异 戊醇 颠倒 混匀 10000rpm 10min 取 上 清液 加 入0 6 0 7V的异丙 醇 预 冷 后 4 20 保 温 沉淀 10000rpm 10min离 心取 沉淀 70 乙 醇 清 洗两 次 吹干 用 TE溶解 DNA 然 后 低 温保 存 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com 应 注 意的 问题 材 料 准备 最好使用 新鲜材 料 低 温保 存的样品 材料不 要反复 冻融 液 氮 研磨 研磨样品 时要有 液氮的 保护 在整个 过程 中 都不要 让液 氮 挥发干净 避免 材料回 温和 反复冻融 带 来的 降解 此外 尽 量将样品 研磨的 很 细 这样 可以提高 DNA产量 细细 胞胞 裂裂 解解 材料应适 量 过 多会影 响裂 解 导致 DNA 量少 纯度 低 高温温浴 时 定 时轻柔 振荡 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com 应 注 意的 问题 DNA沉 淀 用乙 醇或异 丙醇 都可以 异丙醇 沉淀的 效率 要高于无 水乙 醇 试验中 只需 要0 6倍 体积的 异丙醇 沉淀 而需要 2倍体 积的 无水乙 醇 但是异丙 醇沉淀 容易将 盐成 分一起沉 淀 且在 DNA沉淀 中 异丙醇难 以挥发 除去 DNA干 燥 晾干 DNA 让 乙醇充分 挥发 DNA溶 解 若长 期储存 建议 使用T E缓冲液溶解 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com 基基 因组因组 DNA的的 检检 测测 高质量的基因组D NA带 型 单一无拖尾现象 DNA浓度及纯度的 检 测 A260 1 约 50 g mL 双链 DNA A260 280 约为1 8 DNA提取常提取常 见见 问题问题 问 题 一 DNA样 品不 纯 抑 制后 续酶 解和 PCR反 应 原 因 1 DNA中 含有 蛋白 多 糖 多酚 类杂 质 2 DNA在 溶解 前 有酒 精 残 留 酒精 抑制 对 后 续 酶解 反应 策 3 DNA中 残留 有金 属离 子 4 有 RNA的存 留 重 新 纯化 DNA 过吸 附 柱 去 除蛋 白 多糖 多 酚 等杂 质 重 新 沉淀 DNA 让酒 精 充 分 挥发 增 加 70 乙 醇洗 涤的 次 数 2 3次 加 入 RNase降 解 RNA 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com DNA提取常提取常 见见 问题问题 问 题 二 DNA降 解 原 因 1 材 料 不新 鲜或 反复 冻 融 2 未 很 好抑 制内 源核 酸 酶 的 活性 对策 3 提 取 过程 操作 过于 剧 烈 DNA被 机械 打断 4 外 源 核酸 酶污 染 5 反 复 冻融 1 尽 量 取 新 鲜 材 料 低 温保 存材 料 避 免 反 复 冻 融 2 液 氮 研 磨 或 匀 浆 组 织 后 应在 解 冻 前 加 入 裂 解 缓 冲 液 3 在 提 取 内 源 核 酸 酶 含 量丰 富的 材 料 的 DNA时 可 增 加 裂 解 液 中螯 合 剂 的 含 量 细 胞 裂 解 后 的后 续操 作 应 尽 量 轻 柔 4 所 有 试 剂 用 无 菌 水 配 制 耗材 经 高 温 灭 菌 5 将 DNA分 装 保 存 于 缓 冲 液 中 避 免 反 复 冻 融 生 物 秀 专 心 做 生 物 www bb ioo com 生 物 秀 论 坛 学 术 交 流 资 源 共 享 与 互 助 社 区 bbs bb ioo com DNA提取常提取常 见见 问题问题 问 题 三 DNA提 取量 少 原 因 1 实 验 材料 不佳 或量 少 2 破 壁 或裂 解不 充分 对 策 3 吸 附 或沉 淀不 完全 4 洗 涤 时 DNA丢失 1 尽 量 选用 新鲜 幼 嫩 的 材 料 2 植 物 要匀 浆研 磨充 分 3 增 加 吸附 的时 间 或低 温 沉 淀 4 小 心 操作