PCR产物胶回收实验

实验六 PCR产物胶回收实验一、实验目的1. 掌握胶回收的常规操作2. 了解胶回收PCR产物的目的二、实验原理利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度3%，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%55%，0.110kbDNA片段回收率最大为99%，大于10kbDNA片段回收率为2070%。回收的基因组DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学实验。三、试剂及配套设备和材料3.1 试剂Extraction buffer Wash buffer Elution buffer3.2 配套设备和材料无菌1.5ml离心管 各种规格移液器和无菌移液器吸头无水乙醇 异丙醇 可能需要3M KAc (pH 5.0) 离心机四、基本技术参数提取方法操作时间离心柱溶剂提取DNA片段范围洗脱液回收率样本用量离心柱16分钟内完成2个样本750ul60bp23kb99%最大400mg凝胶条适用琼脂糖种类适用电泳缓冲液温育温度高/低熔点琼脂糖TAE/TBE缓冲液50（低熔点琼脂糖）55（普通琼脂糖）五、操作步骤1. 用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或2.0 ml离心管中。 请尽量切去不包含DNA片段的凝胶。一般情况下，电泳的DNA上样量50 ul（50ul为最终洗脱体积）。2. 按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入Extraction buffer。 例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer。对于每人份试剂用量，凝胶质量不能超过400mg。3. 于恒温水浴或金属浴中50温育，直到凝胶融化。 一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔2-3分钟混匀一次。如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10 ul 3M KAc （pH 5.0），使混合液颜色变回黄色。4. 可选：按1：1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。 如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。5. 将混合液全部转移到Spin column内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。 如混合液体积大于750ul可先转移750ul，其余的液体待离心弃液后，再转移。6. 向Spin column内加500ul Extraction Buffer，于12，000g离心3060秒，并弃去接液管内液体。7. 向Spin column内加750ul Wash Buffer，于12，000g离心3060秒，并弃去接液管内液体。 如果回收的DNA片段将用于盐浓度敏感的实验，请在加入Wash buffer后静置25分钟，再离心。8. 再次于12,000 rpm离心1分钟，然后将spin column转移到无菌的1.5ml离心管中。 如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。9. 向Spin column内加50ul Elution Buffer、水或TE溶液，并于室温静置1分钟。 可根据实验的实际需要决定Elution Buffer用量。但不要低于20ul。10. 于12，000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段。 回收的DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20。六、注意事项1. 为了保证没有外源DNA的污染，电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌。2. 为了减少胶的体积，我们可以用相对比较薄的胶来跑电泳，这样可以减少回收试剂引起的一些后续麻烦。2. 在洗脱前，将洗脱液于3060温浴，可提高提取效率。七、思考题1. 简述影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素。2. 简述PCR上样缓冲液（loading buffer）的成分及其作用。