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选修一生物技术实践 知识点总结专题一 传统发酵技术的应用课题一 果酒和果醋的制作1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量 的过程。2、有氧发酵：醋酸发酵 谷氨酸发酵 无氧发酵： 发酵 乳酸发酵 3、酵母菌的代谢类型是 ，它属于真菌 酵母菌的生殖方式： (主要) 分裂生殖 孢子生殖4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，目的是 。 反应式为： 5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵，产生 反应式为 ： 6、20左右最适宜酵母菌繁殖 酒精发酵时一般将温度控制在 7、在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在 表面的野生型酵母菌.在发酵过程中,随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的 也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色.在缺氧呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。8、醋酸菌是单细胞细菌(原核生物),代谢类型是异养 型,生殖方式为 9、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的 分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将 变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 反应式为： 10、控制发酵条件的作用醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。醋酸菌最适生长温度为 ，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。有两条途径生成醋酸：直接氧化和以 为底物的氧化。11、实验流程：挑选葡萄 榨汁酒精发酵果酒（醋酸发酵果醋）12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用 来检验。在 条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现 色。先在试管中加入发酵液2L，再滴入物质的量浓度为3mol/L的 3滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴，振荡试管，观察颜色13、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出 的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的是防止 污染。开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用该装置制酒时，应该 充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入 。疑难解答（1）你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。（2）你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气时只需 瓶盖。（3）制葡萄酒时，为什么要将温度控制在1825？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在3035？温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20左右最适合酵母菌的繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为3035，因此要将温度控制在3035。（4）葡萄汁装入发酵瓶时要留大约 的空间，目的是 ，发酵时应先 ，目的是 。然后再 产生酒精。课题二 腐乳的制作1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是 。其是一种 状真菌。代谢类型是 型。生殖方式是 。营腐生生活。2、原理：毛霉等微生物产生的 能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为 。3、实验流程：让豆腐上长出毛霉 加卤汤装瓶密封腌制4、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵的主要作用：1.创造条件让 生长。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。5、将豆腐切成3cm3cm1cm的若干块。所用豆腐的含水量为 左右，水分过多则腐乳不易成形。6毛霉的生长：条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在 ，并保持一定的温度。来源：1.来自 中的毛霉孢子2. 直接接种优良毛霉菌种,这样可以 时间：5天7加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而 ，接近瓶口表面的盐要 一些。加盐腌制的时间约为 天左右。8用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制 ，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味9食盐的作用：1.抑制微生物的生长，避免腐败变质2. ，使豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂 3. ，给腐乳以必要的咸味 4.浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。10配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种 料配制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右。11酒的作用：1 2.与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味 3.酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也 ，使腐乳成熟期 ；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。12香辛料的作用：1. 2 3.参与并促进发酵过程13防止杂菌污染：用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。疑难解答（1）利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？豆腐生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。（2）为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。（3）我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？含水量为70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。（4）吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它对人体有害吗？它的作用是什么？“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。课题三 制作泡菜1制作泡菜所用微生物是乳酸菌，其代谢类型是 型。在无氧条件下，降糖分解为乳酸 。分裂方式是 。反应式为： 含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素 。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。2亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。3膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，国家规定肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，婴儿奶粉中不超过2mg/kg。亚硝酸盐被吸收后随 排出体外，但在适宜pH 、温度和一定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺。4.一般在腌制 天后亚硝酸盐含量开始降低，故在10天之后食用最好亚硝酸盐含量发酵时间（d）*测定亚硝酸盐含量的原理是在 条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与 N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成 红色染料，与已知浓度的标准显色液 比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。 专题二 微生物的培养与应用课题一 微生物的实验室培养1培养基：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。（1）培养基按照物理性质可分为 半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的 。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基应用于工业或生活生产，固体培养基应用于微生物的 ，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。（2）按照化学成分可分为人工合成培养基和 。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。（3）按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和 。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以 不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种 或 配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。（4）培养基的化学成分包括 、生长因子等。碳源：能为微生物的代谢提供 元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。氮源：能为微生物的代谢提供 元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。（5）培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及 的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供 的条件2无菌技术获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：对实验操作的空间、操作者的 ，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行 。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。（1）消毒与灭菌的区别消毒指使用较为 的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有 （如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的 ，包括芽孢和孢子。灭菌方法有 ， ， ，灭菌方法：接种环、接种针、试管口等使用 灭菌法；玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是 灭菌箱 ； 培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是 灭菌锅 。表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能3制作牛肉膏蛋白胨固体培养基（1）方法步骤：计算、称量、溶化、 、倒平板。（2）倒平板操作的步骤：将灭过菌的培养皿放在 旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约1020mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。等待平板冷却凝固，大约需510min。然后，将平板 放置，使培养皿盖在下、皿底在上。倒平板操作的讨论（1）培养基灭菌后需要冷却到 左右时才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。（2.）为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。（3）.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。（4.）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。4纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法最常用的是 法和 法。（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是 。 （3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到 的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成 ，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。（5）平板划线法操作步骤：将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。将试管口通过火焰。将已 的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。将试管通过火焰，并塞上棉塞。左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的 端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最 后一区的划线与第一区 。将平板倒置放入培养箱中培养。平板划线操作的讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答： ，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的 开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。（6）涂布平板操作的步骤：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液，滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810s。用 将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布平板操作的讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。5菌种的保存（1）对于 的菌种，可以采用临时保藏的方法。临时保藏方法将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4的冰箱中保藏。以后每36个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用 的方法。在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在20的 中保存。疑难解答（1）生物的营养营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。（2）确定培养基制作是否合格的方法将未接种的培养基在 中保温12天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素 是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿分解成氨之后才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成 尿素最初是从人的尿液中发现的1.筛选菌株（1）实验室中微生物的筛选应用的原理人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括 、 、 等），同时抑制或阻止其他微生物生长。（2）选择性培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养 微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能 的微生物；加入高浓度的 可选择培养金黄色葡萄球菌等。2.统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。（2）稀释涂布平板法统计样品中 菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个 ，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置35个平板，选择菌落数在 的平板进行计数，并 值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30300之间的平板进行计数2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物3.设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中 对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。4.实验设计实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。（1）土壤取样：在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约38cm的土壤层取样。（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用104 105 106测定放线菌的数量，一般选用103 104 105 测定真菌的数量，一般选用102 103 104（3）微生物的培养与观察不同种类的微生物，往往需要不同的培养 和培养时间。细菌3037 12天，放线菌2528 57天 霉菌2528 34天每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。如 、大小、隆起程度、颜色疑难解答（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计 个平板，计算出平板菌落数的平均值每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数课题三 分解纤维素的微生物的分离纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。1.纤维素与纤维素酶（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 酶、 酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成 ，为微生物的生长提供营养。2.纤维素分解菌的筛选（1）筛选方法： 染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的 。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。3.分离分解纤维素的微生物的实验流程土壤取样选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定） 将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落（1）土壤采集 选择富含纤维素的环境。（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌悬液、 （3）刚果红染色法种类一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。疑难解答（1）为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。（2）将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。（3）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。专题三 植物的组织培养技术 课题一 菊花的组织培养1.植物组织培养的基本过程细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现 的过程。离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织，愈伤组织的细胞排列 而无规则，是一种高度 化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的 ，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做 。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物细胞工程具有某种生物全套遗传信息的任何一个活细胞，都具有发育成完整个体的能力，即每个生物细胞都具有 。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在特定的时间和空间条件下，通过基因的 ，构成不同组织和器官。植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作 种子；培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。2.影响植物组织培养的条件材料：植物的种类、材料的 和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物的 作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培养基是 培养基，其中含有的大量元素是 ，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、 等。激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其 、使用的 、用量的 等都影响结果。使用顺序实验结果先生长素，后细胞分裂素有利于分裂但不分化先细胞分裂素，后生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率提高生长素 细胞分裂素比值与结果比值高时促根分化，抑芽形成比值低时促芽分化，抑根形成比值适中促进愈伤组织生长 +3.环境条件：PH、温度、光等环境条件。 不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在 左右，温度控制在 ，并且每日用日光灯照射 h. 4、 操作流程.配制MS固体培养基：配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液（培养基母液）。（1）使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。（2）配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、 、有机物和 的母液，并用蒸馏水定容到1000毫升。（3）在菊花组织培养中，可以不添加植物激素 原因是菊花茎段组织培养比较容易。（4）灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。（5）MS培养基中各种营养物质的作用是什么？与肉汤培养基相比，MS培养基有哪些特点？大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的 ；蔗糖提供 ，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞特殊 需求。（6）微生物培养基以有机营养为主，MS培养基则需提供大量 营养。外植体的消毒 外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。注意：对外植体进行表面消毒时，就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的 。接种：接种过程中插入外植体时形态学 端朝上，每个锥形瓶接种78个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求 操作。培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（1822）和光照（12h）移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行 。最后进行露天栽培。栽培 ：外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染；锥形瓶密封性差等。课题二 月季的花药培养1.被子植物的花粉发育 花粉是由 细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、 和双核期等阶段。注意：成熟的花粉粒有两类，一类是二核花粉粒，其花粉粒中只含花粉管细胞核和生殖细胞核，二核花粉粒的精子是在花粉管中形成的；另一类是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖细胞就进行一次有丝分裂，形成两个精子，此花粉粒中含有两个精子核和一个花粉管核（营养核）花粉发育过程中的四分体和动物细胞减数分裂的四分体不同。花粉发育过程中的四分体是花粉母细胞经减数分裂形成的4个连在一起的单倍体细胞；而动物细胞减数分裂过程中的四分体是联会配对后的一对同源染色体，由于含有四条染色单体而称为四分体。同一生殖细胞形成的两个精子，其基因组成完全相同。2.产生花粉植株的两种途径通过花药培养产生花粉植株（即 植株）一般有两种途径，一种是花粉通过胚状体阶段发育为植物，（1）花药中的花粉 从芽 移栽另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。（2）花药中的花粉 从芽 移栽这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中 及其 配比。注意：无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根胚状体：植物体细胞组织培养过程中，诱导产生的形态与受精卵发育成的胚非常类似的结构，其发育也与受精卵发育成的胚类似，有胚芽、胚根、胚轴等完整结构就像一粒种子，又称为细胞胚。3.影响花药培养的因素： 与培养基的组成是主要的影响因素（1）亲本的生理状况：选择月季的 期。（2）合适的花粉发育时期：一般来说，选择单核期，（3）花蕾：选择 的花蕾（4）材料的选取：选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法是醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用 法，这种方法能将花粉细胞核染成 色（5）材料的消毒（6）接种和培养：灭菌后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位长生愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，专题五 和蛋白质技术课题一的粗提取与鉴定一实验原理：1提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA 酒精。2DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？要使DNA溶解，需要使用什么浓度？要使DNA析出，又需要使用什么浓度？在0.14mol/L时溶解度最 ；较高浓度可使DNA溶解；0.14mol/L可使DNA 。3在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液；4将DNA分子析出的方法是：向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入 ，以稀释NaCl溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精（特别是95冷却酒精），但细胞中蛋白质可 酒精。从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。5采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？ 将 和 进一步分离。6洗涤剂在提取DNA中有何作用？洗涤剂将细胞膜上的 溶解，从而瓦解细胞膜。7当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用什么指示剂进行鉴定？在沸水浴条件下，DNA遇 呈现蓝色。原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用 鉴定提取的物质 是否是DNA。二实验过程1.实验材料的选取不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时应本着DNA含量 、材料易得便于提取的原则。本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。2.破碎细胞，获取含DNA的滤液（1）若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA的滤液？在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集 ；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐， ，过滤后收集滤液。（2）为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。（3）在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。答：血细胞在蒸馏水中吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA物质；用尼龙布进行过滤。（4）在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？答：研磨是为了破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分会使DNA的提取量减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。（5）具体做法。10mL鸡血20mL蒸馏水同方向搅拌3层尼龙布过滤滤液3.去除滤液中的杂质（1）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。（2）最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。4.析出与鉴定（1）在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA呈何颜色？滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置23分钟，析出的白色丝状物就是DNA。DNA呈白色。（2）怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢？具体做法。试管2支，编号甲乙各加等量5mLNaCl溶液甲中放 入少量白色丝状物，使之溶解各加4mL二苯胺，混合均匀沸水浴5min观察颜色变化5.实验操作制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静置或离心破碎细胞，释放DNA 加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌过滤，除去细胞壁、细胞膜等。溶解核内DNA 加入NaCl至2mol/L，同一方向缓慢搅拌DNA析出 加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到2mol/L溶液中除去细胞质中的大部分物质。DNA初步纯化 与等体积95冷却酒精混合，析出白色丝状物除去核蛋白、RNA、多糖等。DNA鉴定 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。专题六植物有效成分的提取课题一植物芳香油的提取天然香料的来源：植物、动物不同植物的根、茎、叶、花、果实、种子都可以提取芳香油。芳香油的提取方法： ， ， 等。芳香油的性质：挥发性强，成分复杂，以萜类化合物及其衍生物为主。1水蒸气蒸馏法：原理：水蒸汽可将挥发性较强的芳香油携带出来形成油水混合物，冷却后水油分层。方法： 蒸馏：原料放在沸水中加热蒸馏。 蒸馏：原料隔放在沸水上加热蒸馏。 蒸馏：利用外来高温水蒸气加热蒸馏。不足：有些原料不适宜于水中蒸馏，如柑橘、柠檬等易焦糊，有效成分 。通常用 法（通过机械压缩力将液相物从液固两相混合物中分离出来的一种简单操作）2萃取法：原理：芳香油 溶于有机溶剂，溶剂挥发后得到芳香油。如石油醚、酒精、乙醚等。方法：原料浸泡在溶剂中得到浸泡液有机溶剂挥发芳香油。不足：有机溶剂中的 影响芳香油的品质 3蒸馏装置：如右下图4玫瑰精油的提取（1）0.1g/mL氯化钠溶液：促使油水混合物（乳浊液）中油和水的分离。无水硫酸钠：吸收油层中的水分。实验步骤：采集玫瑰花：采集 期的玫瑰花，清水清洗沥干。装入蒸馏原料：称取50g玫瑰花放入蒸馏瓶，添加200mL蒸馏水。安装蒸馏装置：按照从左向右、自下到上 次序安装水蒸气蒸馏装置。加热蒸馏：控制蒸馏 （12滴/秒），获得乳白色乳浊液；拆卸装置。分离油层：向乳浊液加入NaCl溶液后，利用 分离出上面的油层。除去水分：向油层中加入 ，24h后过滤，得到玫瑰油。注意事项：蒸馏时间不能 ，温度不能 。5橘皮精油的提取橘皮精油的主要成分：柠檬烯，主要分布在橘皮中。石灰水：防止 ，提高出油率，降低压榨液黏稠度，过滤不堵塞筛眼。小苏打、硫酸钠：促进 的分离（用量分别为橘皮质量的0.25和5）。实验步骤：橘皮的处理：将新鲜橘皮用清水清洗沥干。 浸泡：用78石灰水浸泡橘皮24h。 漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净，沥干。粉碎和压榨：将橘皮粉碎，加入小苏打和硫酸钠后，用压榨机压榨得到压榨液。 压榨液：用布袋过滤，滤液再高速离心处理，分离出上层橘皮油。静置处理：将橘皮油在510冰箱中静置57d，分离出上层澄清橘皮油。再次过滤：将下层橘皮油用滤纸过滤，滤液与上层橘皮油合并，得到橘皮精油。分析：静置处理目的：除去果蜡和水分。课题二胡萝卜素的提取1胡萝卜素性质：橘黄色结晶，化学性质比较稳定不溶于 ，微溶于乙醇 溶于石油醚等有机溶剂。依据碳碳双键的数目划分为、 三类。其中最主要的组成成分为-胡萝卜素。作用：治疗 症、幼儿生长发育不良、干皮症等疾病；常用于食品色素；使癌变细胞恢复成正常细胞。提取胡萝卜素的方法主要有三种：从植物中提取从大面积养殖的岩藻中获得利用微生物的发酵生产2实验步骤：粉碎：-干燥：-萃取-过滤-浓缩3萃取剂的选择：水溶性的：乙醇、丙酮水不溶性的：石油醚、乙酸乙酯、 乙醚、苯、四氯化碳等选择：具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶。所以最理想的萃取剂是 4影响萃取的因素（1）主要因素：萃取剂的 和使用量（2）次要因素：原料颗粒的 、紧密程度、含水量、萃取的 和 等一般来说，原料颗粒小，萃取温度高，时间长，需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果就好。萃取前，要将胡萝卜进行 和干燥5胡萝卜素提取（1）萃取过程应该避免 加热，采用 加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧爆炸。（2）为了防止加热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装置。（3）萃取液的浓缩可直接使用蒸馏装置。在浓缩之前，还要进行过滤，除去萃取液中的不溶物。6鉴定：纸层析法（1）滤纸： （2）基线：滤纸下端距底边2处做一基线在基线上取 四点。（3）点样：用最细的注射器针头（毛细吸管）吸取 进行点样。（4）等滤纸上的点样液自然挥发干后，将滤纸卷成 状，至于装有深的石油醚的密封玻璃瓶中。等各种色素完全分开后，观察标准样品中位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带。疑难解答乙醇和丙酮能够用于胡萝卜素的萃取吗？为什么？答：胡萝卜素可溶于乙醇和丙酮，但它们是水溶性有机溶剂，因萃取中能与水混溶而影响萃取效果，所以不用它们作萃取剂。2.在石油醚、醋酸乙酯、乙醚、苯和四氯化碳这几种有机溶剂中，哪种最适宜用来提取胡萝卜素？答：在这五种有机溶剂中，石油醚的沸点最高，在加热萃取时不易挥发，所以石油醚最适宜用作萃取剂。提取方法实验原理方法步骤适用范围水蒸气蒸馏 利用水蒸气将挥发性较强的芳香油携带出来1.水蒸气蒸馏2.分离油层3.除水过滤 适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油压榨法 通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油1.石灰水浸泡、漂洗2.压榨、过滤、静置3.再次过滤 适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取有机溶剂萃取 使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶剂后就可获得芳香油1.粉碎、干燥2.萃取、过滤3.浓缩 适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶液中