动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法 编制说明

编制说明项目名称：动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法 项目编号： 内质监标函（2018）154号-107号 编制单位： 呼和浩特海关 编制时间： 2018.6-2019.12 一、 工作简况本标准根据关于下达2018年第一批内蒙古自治区地方标准制修订项目计划的通知内质监标函（2018）154号，本标准是由呼和浩特海关提出并归口，项目计划编号为107号。呼和浩特海关牵头成立由相关领域的专业技术人员和具有标准化专业知识的人员组成的标准起草组。起草组在充分调查研究、综合分析和试验验证的基础上，起草标准初稿和编制说明，并广泛征求意见。对意见进行汇总整理，修改完善标准初稿，形成地方标准征求意见稿。第一起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关；第二起草单位：内蒙古农业大学；第三起草单位：鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心；第四起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。主要起草人：赵治国、郭晓宇、张晓东、敖威华、王海艳、崔强、陈林军、延涵、李军燕、罗晓平。二、标准制定的背景及意义动物垫料与动物关系密切。近年来随着生物科学研究的飞速发展，动物作为其研究中不可缺少的重要组成部分，备受各国政府的重视和科学家的关注。垫料是为动物营造舒适的人工环境，进行环境控制的基础条件和必要材料，是对动物产生直接作用和影响的环境因素。动物垫料与动物健康、福利息息相关，同时也对养殖业、动物及其相关科研方面甚至社会经济发展有十分重大的影响。因此，垫料的质量评定与控制非常必要。 我国动物垫料标准化、商品化尚处于初级阶段。欧美等发达国家早已实行垫料商品化生产，有专业的工厂，并且各道工序的质量要求非常严格。但我国对动物垫料的研究还处于初级阶段，与垫料相关的文献报道甚少，垫料生产监管环节薄弱，检测标准缺乏。近年来我国政府及从业人员逐渐认识到动物垫料中存在的问题，开始对垫料质量评价方面的问题进行改进。因此要想使动物的质量管理与国际接轨，动物垫料生产的标准化就显得至关重要。我国动物垫料标准化和质量管理相对滞后，影响相关行业发展。我国对动物垫料的研究才刚刚起步，现行的国家标准和实验动物相关管理条例中，对动物垫料的标准化规定几乎空白，稀数资料对于垫料的规定只有：应选用吸湿性好、尘埃少、无异味、无毒性、无油脂的材料；须经消毒、灭菌后方可使用。如此笼统的规定在一定程度上制约了我国动物垫料标准不能紧跟国际标准，同时限制了药品、生物制品、动物等产品的出口，还使科研论文将不能被同行接受。因此要想提高相关学科竞争力，就必须加强垫料标准化和质量管理，从动物垫料微生物指标监测入手。我国动物垫料微生物检测标准几乎空白，亟待建立相关标准。近年来，我国政府及从业人员逐渐认识到动物垫料对动物健康及下游产业的重大意义，垫料相关研究报道逐年增多，积累了一定的理论基础。但目前，我国尚未对国内垫料质量建立统一评价体系、风险分析、国家标准及配套法规。其中，垫料中微生物特别是致病微生物的含量对动物健康、福利和产品等影响重大，但目前动物垫料中微生物检测标准属于空白，亟待建立科学完善的动物垫料微生物检测标准，该工作将对国内垫料建立统一质量评价体系、风险分析及产品标准等有力促进。动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌对动物的危害极大。动物垫料单核细胞增生李斯特氏菌是影响动物健康和动物实验结果的国际公认的重要环境因素之一，因此动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌的检测十分重要。该菌广泛存在于自然界中，在4的环境中仍可生长繁殖，已知牛、羊等40多种哺乳动物与20多种禽类可被该菌感染，可从鱼类、蜱类、蝇类及甲壳动物分离该菌并可引起多种动物发病，是反刍动物脑炎及流产的常见原因。同样，该菌对公共卫生意义重大，WHO将其列为21世纪四大食源性致病菌之一。1%5%的正常人及10%20%的屠宰场工作人员为无症状肠道带菌，病菌由消化道排出，广泛污染泥土、水及周围环境。该菌感染能引起人畜李斯特氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。2014年7月，国家风险评估中心开展的单增李斯特氏菌(L. monocytogenes)感染病例监测结果显示，监测病例数7534人，阳性病例14人。建立动物垫料单核细胞增生李斯特氏菌检测标准，保障动物健康急不可待。动物垫料与动物粪便直接接触，容易滋生细菌，从而威胁动物的健康与福利，并且对养殖业的发展与国际间动物及产品贸易带来巨大的影响，甚至威胁到人类社会的生产与生活。但是对于动物垫料单核细胞增生李斯特氏菌检测标准几乎空白，还没有统一的标准和方法，所以建立动物垫料单核细胞增生李斯特氏菌检测标准已刻不容缓。本实验室具有多年微生物检测的经验，本方法的开发和应用，在检测技术方面填补我区的空白、弥补了自治区没有现行标准的不足，能够使动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌的检测更加高效、准确、安全。本方法的开发和应用将会使我区在动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌的检测先进性方面达到国内领先水平，为我区动物垫料质量安全管理部门更快更好的管控提供可靠保障。因此，加强动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌的检测对确保全区农业持续、健康发展具有重要的现实意义。三、主要起草过程2018.06-2018.09 地标前期基础工作：收集动物垫料样本，查阅单核细胞增生李斯特氏菌资料，检索单核细胞增生李斯特氏菌检测的相关文献及标准。2018.10-2019.09 前期实验条件的摸索：包括前处理方法的优化、对照，不同垫料中单核细胞增生李斯特氏菌的检出率，最终确定实验方案，编写编制说明。2019.10-2019.11 验证单位进行验证。2019.12 编写地标并定初稿。四、现行法律、法规和强制性标准的关系本标准遵循GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写和GB/T 20001.4-2015 标准编写规则 第4部分：试验方法标准的规则编写。还参照相关国家标准编写指南的要求。在编制本标准的过程中参考了以下标准：ISO 11290-1:2017 Microbiology of the food chain-Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. Part 1: Detection method、 AOAC Official Method 993.12Listeria monocytogenes in Milk and Dairy Products、FDA Bacteriological Analytical ManualChapter 10Detection ofListeria monocytogenesin Foods and Environmental Samples, and Enumeration ofListeria monocytogenesin Foods、GB 14925-2010实验动物环境及设施、GB 4789.30-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验、GB/T 33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则、GB/T 22429食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验 酶联免疫法、NY/T 1902-2010饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验。综合参考了国内外与单核细胞增生李斯特氏菌检测相关的检测标准，力求该标准能够高效准确的检测垫料中单核细胞增生李斯特氏菌，同时兼顾标准的广泛应用。本标准完全符合现行法律法规和强制性标准规定，不存在任何与现行法律法规和强制性标准相违背之处。相关强制性标准2项：GB 14925-2010 实验动物 环境及设施，本标准规定了实验动物及动物实验设备和环境的技术要求及检测方法，同时规定了垫料、饮水和笼具的原则要求。但针对垫料该标准仅规定了“垫料的材质应符合动物的健康和福利要求，应满足吸湿性好、尘埃少、无异味、无毒性、无油脂、耐高温、耐高压等条件；垫料必须经灭菌处理后方可使用” 。GB 4789.30-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验。本地标适用于垫料中单核细胞增生李斯特氏菌检测，明确规定了不同类别垫料取样方法，标准中单核细胞增生李斯特氏菌鉴定过程增加了新的鉴定手段，确保检测结果更加准确。5、 主要内容及检测方法的确定5.1 取样方法的确定及优化根据动物垫料的物理性状将其分为颗粒状/粉末状垫料和平面状垫料，针对不同性状的垫料采取不同的取样方法。5.1.1 颗粒状或粉末垫料样品取样方法国内外食品和饲料中单核细胞增生李斯特氏菌检测法中常用的取样方法为称取法，本标准中针对颗粒状或粉末垫料样品（木屑、玉米芯、秸秆、纸屑等）参考通用做法采用称取25 g的方法进行取样。5.1.2 平面垫料样品取样方法针对平面垫料（胶垫、托盘等）采用表面涂抹取样法，无菌操作将涂抹25 cm2-100 cm2平面样品的棉拭子置入装有 25 mL-100 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌容器中，混匀作为原液。5.2 稀释液和培养基的选择5.2.1 预增菌稀释液的选择国内外标准和资料中用到的预增菌稀释液主要有：缓冲李斯特氏菌增菌肉汤(BLEB)、Fraser增菌肉汤、胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB-YE）、UVM肉汤、李氏增菌肉汤（LB）等液体培养基，除UVM肉汤抑制非目标菌的作用稍差一点，其它几种增菌液效果差异不明显。垫料中营养成分不丰富，存在的单核细胞增生李斯特氏菌容易以亚损伤状态存在，如果用抑菌作用太强的液体培养基进行一步增菌，容易导致目标菌死亡，因此，本方法选择使用 Fraser肉汤基础，分别添加了不同量的吖啶黄素、萘啶酮酸（具有抑菌作用）制成Half Fraser肉汤和Fraser肉汤，进行2步液体增菌，同时抑制非目标菌增殖。另外，该增菌液添加了七叶苷和柠檬酸铁铵，李斯特氏菌可以水解七叶苷，与培养基中的铁离子反应，使培养基变黑，可直观的从培养液的颜色就可以判断是否有李斯特氏菌的生长。5.2.2 分离培养基国内外标准常用的分离培养基为：牛津琼脂（OXA）、PALCAM 琼脂、单核细胞增生李斯特氏菌显色培养基和胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA-YE），前3种培养基均具有较好的选择性，也是国内外标准常用的分离培养基，但单核细胞增生李斯特氏菌在OXA琼脂和显色培养基上的形态更易识别，TSA-YE培养基常用于该菌纯培养。因此，本标准选用OXA琼脂和单核细胞增生李斯特氏菌显色培养基用于分离培养，TSA-YE培养基用于纯化培养。5.3 典型或可疑菌落的鉴定本标准对典型或可疑菌落的鉴定过程，参考了国内外单核细胞增生李斯特氏菌检测标准和药典等成熟做法，综合了溶血试验、生化试验及辅助设备鉴定等必要鉴定过程，在传统鉴定方法基础上，将全自动微生物生化鉴定系统鉴定法和飞行时间质谱鉴定法增加到标准中，做到了与国际接轨，缩短检测时间，增加检测通量，提升检测结果准确率，减少检测人员工作量。5.4 培养时间和温度单核细胞增生李斯特氏菌在4 45 均能生长，最适生长温度30 37 ，国内外多数标准均采用30 1 预增菌，在36 1 进行选择性琼脂平板培养。本标准将继续采用以上培养温度对单核细胞增生李斯特氏菌进行检测培养。本标准各种培养基培养时间也与国内外标准常用时间相统一。5.5 其他 本标准增加了单核细胞增生李斯特氏菌检测过程中回避人员及相关生物安全措施，确保检测工作中不造成人员感染，避免环境污染。六、方法验证为验证本方法的有效性和适用性，选择5家不同行业的检测机构对本方法进行验证，验证内容为方法的适用性、准确度、检出率及相关样品的检测，结果显示该方法稳定可靠，符合相关要求。七、结论综上所述，本标准在制定过程中所涉及到的各项技术指标均经过方法学的验证，并切实可行，完全达到了编制标准的要求。八、重大意见分歧的处理依据和结果未发生。九、国内外情况简要说明国内尚没有建立统一的国家标准检测方法。检索国家标准1项和地方标准3项：GB 14925-2010 实验动物 环境及设施、江苏省地方标准DB32/T 2129-2012 实验动物 垫料、北京市地方标准DB11/T 1126-2014实验动物 垫料和河北省地方标准DB13/T 2547-2017实验动物 垫料。根据文献报道尚未发现内蒙古自治区内有相关单位从事这项研究。10、 标准草稿征求意见情况汇总表序号意见提出单位/专家采纳不采纳（说明原因）1建议在标准适当位置增加“单核细胞增生李斯特氏菌检测流程图”。包头海关技术中心（原包头出入境检验检疫局技术中心）/张鹏翔采纳2建议将新型“飞行时间质谱法”加入到标准。赤峰海关技术中心（原赤峰出入境检验检疫局技术中心）/曹旭采纳3无修改建议。二连浩特海关技术中心（原二连浩特出入境检验检疫局技术中心）/杨帆4无修改建议。满洲里海关技术中心（原满洲里出入境检验检疫局技术中心）/杨东来参考文献：1 GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则2 GB/T 20001.4-2015 标准编写规则 第4部分：试验方法标准3 GB 14925-2010 实验动物 环境及设施4 GB 4789.30-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验5 SN/T 3872-2014 出口食品中四种致病菌检测方法 MALDI-TOF-MS法6 SN/T 2552.12-2010 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第12部分：单核细胞增生李斯特氏菌检测与计数7 食品安全地方标准 阪崎肠杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌检测，DBS13/ 003-2015.8 NY/T 1902-2010 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验9 DB32/T 2129-2012 实验动物 垫料10 DB11/T 1126-2014实验动物 垫料11 ISO 11290-1:2017 Microbiology of the food chain-Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp.12 AOAC Official Method 993.12 Listeria monocytogenes in milk and Dairy products.13 Bacteriological Analytical Manual Chapter 10, Detection ofListeria monocytogenesin Foods and Environmental Samples, and Enumeration ofListeria monocytogenesin Foods.