恩施黑猪PTGFR基因SNP检测及遗传多态性分析开题报告.doc

长江大学毕业设计（论文）开题报告题 目 名 称 恩施黑猪PTGFR基因SNP检测及遗传多态性分析题 目 类 别 毕 业 论 文 学 院（系） 动物科学学院 专 业 班 级 动科31002班 学 生 姓 名 毕 四 海 指 导 教 师 杨 军 辅 导 教 师 罗 家 琴 开题报告日期 2013年12月7日 恩施黑猪PTGFR基因SNP检测及遗传多态性分析学 生：毕四海 长江大学动物科学学院指导教师：杨 军 长江大学动物科学学院1 题目来源本题目来自于生产实践。2 研究目的和意义猪肉是我国人民膳食结构中动物蛋白的主要来源，在猪的许多经济性状中，除生长速度、饲料利用率和瘦肉率以外，繁殖性状也是影响养猪生产与经济效益的基本因素。猪的繁殖性能作为衡量其生产力的重要标准，它由几个主基因或数量性状位点控制，妊娠期是繁殖性状中的一个重要的指标，通过缩减妊娠期可以提高猪的生产性能，但是单纯的通过表型是很难进行选择的，并且利用常规的选择方式所需要的时间周期也是特别长的。利用分子技术来对猪的妊娠期性状进行选择将会大大提高选择的效率和准确率。在过去的半个世纪里，通过常规育种技术，猪的许多重要经济性状都在遗传上得到了很好的改良(如瘦肉率，背膘厚等)，但对繁殖性状的改良却十分有限，这主要是因为该性状遗传力低，受环境因素影响大。几十年来，西方猪种在此性状上的改进效果很小，传统的育种方法其育种周期长，遗传进度小，因此开发和利用新的选育标记来提高猪的繁殖性能就倍受重视。前列腺素F2（PTGF2）在哺乳动物繁殖过程中起重要作用，它与排卵、黄体溶解、分娩、子宫平滑肌收缩等生理过程密切相关。在分娩早期母猪就通过PGF2调控大脑与子宫的相互作用从而引起产前行为的改变。本研究拟建立恩施黑猪前列腺素F2受体基因（PTGFR）多态性检测的PCR-RFLPs方法，对恩施黑猪前列腺素F2受体基因（PTGFR）多态性进行检测，同时与妊娠期短的清平猪前列腺素F2受体基因（PTGFR）多态性进行对比，为猪妊娠期的分子遗传调控研究奠定基础。3 阅读的主要参考文献及资料名称1 Makino S, Zaragoza DB, Mitchell BF, et al. Decidual activation: abundance and localization of prostaglandin F2 receptor (FP) mRNA and protein and uterine activation proteins in human decidua at preterm birth and term birthJ. Placenta, 2007, 28 (5-6): 557-565.2 李杰之, 常晓彤, 林坚等. 从动物组织提取高纯度总RNA方法的改进及应用J. 生物技术通讯, 2002, 05 (03) :46-48. 3 Gall M A. Induction of parturition in swine with prostaglandin F2, estradiol benzoate and oxytocinJ. Theriogenology, 1987, 27: 4934 王建辰, 刘智喜, 郭顺元等. 前列腺素15甲基F2对母猪同期分娩的初步试验J. 中国畜牧杂志, 1980, (1) :265 蔡正华, 方樟明, 陈隆等. 前列腺素控制母猪分娩时间的试验简报J. 当代畜牧, 1993, 41 (1) :25.6 Chollet A, Tos EG, Cirillo R. Tocolytic effect of a selective FP receptor antagonist in rodent models reveals an innovative approach to the treatment of preterm labor. BMC Pregnancy Childbirth 2007, 7 (Suppl 1): S16.7 Ou CW, Chen ZQ, Qi S, Lye SJ. Expression and regulation of the messenger ribonucleic acid encoding the prostaglandin F(2alpha) receptor in the rat myometrium during pregnancy and laborJ. 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Distinct mechanisms regulate induction of messenger ribonucleic acid for prostaglandin G/H syn-thase-2, PGE (EP3) receptor, and PGF2a receptor in bovine preovula-tory folliclesJ. Endocrinology, 1996, 137: 3348335525 Rueda B R, Botros I W, Pierce K L, Regan J W, Hoyer P B. Comparison of mRNA levels for the PGF2a receptor (FP) during luteolysis and early pregnancy in the ovine corpus luteumJ. Endocrine, 1995, 3: 7817874 国内外现状和发展趋势与研究的主攻方向4.1 国内外现状在猪的许多经济性状中，除生长速度、饲料利用率和瘦肉率以外，繁殖性状也是影响养猪生产与经济效益的基本因素。猪的繁殖性能作为衡量其生产力的重要标准，它由几个主基因或数量性状位点控制，妊娠期是繁殖性状中的一个重要的指标，通过缩减妊娠期可以提高猪的生产性能，但是单纯的通过表型是很难进行选择的，并且利用常规的选择方式所需要的时间周期也是特别长的。利用分子技术来对猪的妊娠期性状进行选择将会大大提高选择的效率和准确率。而对检测前列腺素F2受体基因（PTGFR）位点上是否具有多态性，目前国内外尚无相关研究，鉴于前列腺素F2受体基因（PTGFR）的相关重要性，与猪的排卵、黄体溶解、分娩、子宫平滑肌收缩等生理过程密切相关，而肿瘤坏死因子和白介素对其的表达起着调节的作用。对其的研究成为当前世界各国的研究的主攻方向。4.2 研究主攻方向4.2.1 猪的基因定位猪的基因定位工作已取得较大成就，猪基因图谱的饱和度日趋增加，足已进行各类QTL及其标记的定位研究工作 。Wikie等(1996)发现，在猪8号染色体上存在控制排卵率的QTL。在这之后，Rathje等(1997)也证实了这一结果。在梅山猪x大白猪资源群体中，在SSC3、SSC4、SSC7和SSCS上分别检测到影响排卵率的4个QTL(Rohreretal.，1999:Bidanaletal.，Zoolb:Campbelletal.，2003)。在繁殖性状选择系X对照系杂交群体中，sseg上同样定位了该性状的QTL（Cassadyetal.，2001)。此外，Rathjie等(1997)研究结果显示，在15号染色体上也存在控制排卵率的QTL，其加性效应为-0.86个，显性效应为-4.28个。Rathjie等(1997)认为4号和13号染色体上也存在控制排卵率的QTL。4号染色体上影响排卵率的QTL位点与微卫星标记SW589的距离为seM，与SW512的距离为cM，经估计其加性效应为0.42个，显性效应为3.19个。但该QTL估计的p值为0.10，因此实验结果很可能是假阳性。13号染色体上控制排卵率的QTL，位于标记SW935附近，其加性效应为-2.33个，显性效应为-3.46个。由加性效应和显性效应的比率推断，该QTL可能以显性或超显性方式遗传。Rohrer等(1999)认为，控制排卵率的QTL还存在于3、9、10号和X染色体上。其中3号染色体上排卵率性状QTL遗传方式为完全加性遗传，加性遗传效应估计为-2.20个。在X染色体上尽管连锁分析的结果没有达到闭值，但仍可能存在影响排卵率和子宫容量的QTL。Wilkie等(1999)将该QTL定位于猪8号染色体上，位于标记SW444附近，其侧翼标记为SW906和50086。Wilkie等(1999)在梅山猪大白猪资源家系(resouree family)中，用猪所有18条常染色体上平均间距为24cM的119个微卫星标记分析了青年母猪的基因型。结果发现，1号染色体上在微卫星标记SW143O和SW373之间存在影响妊娠期的QTL。此区域的遗传距离是1.66eM，该QTL的估计加性效应为(1.180.55)d。Paszek等(1998)认为，在9号染色体上可能存在控制妊娠期的QTL。Wilkie等(1999)将该QTL定位于SW174和SW1651之间，并估计加性效应为1.52d。随着猪基因组测序计划的推进和完成，分离鉴定这些QTL背后的效应基因将成为当前世界各国的研究的主攻方向。4.2.1 前列腺素F2受体基因（PTGFR）的研究近年有许多关于脱碘酶的研究，以D1居多。脱碘是调节甲状腺激素生物活性的特别方式，通过在外环脱碘，T4转化为有生物活性的3，3，5一三碘甲腺原氨酸(T3 )，或内环上脱碘而成为无生物活性的代谢产物3，3，5 -甲腺原氨酸(rT3)；继续内环脱碘，T1进一步转变为无生物活性的3，3，一二碘甲腺原氨酸(3，3，一T2 )；少量碘甲腺氨酸硫酸盐迅速脱碘通过胆汁、尿排出或进入血液。这种以 T4、T3、rT3 及碘甲腺氨酸硫酸盐为基质的脱碘过程由三种碘甲腺氨酸脱碘酶，即I型、型和型(D1、D2和D3)所催化。这三种脱碘酶的组织分布、催化和底物特性、生物学功能和调节条件均不同。D2存在于星形胶状细胞中，D2只有外环脱碘活性，脑组织中的T3主要是在D2的作用下从T4转化而来；D2是一种膜整合蛋白，其结构比D1更利于T4的脱碘。当甲状腺功能状态改变时，D2对保护中枢内T3的稳定性起了重要作用。D3主要分布于脑，特别是胎盘、胎脑。D3只有内环脱碘活性，T4和T3由其催化而失活。D3的功能是调节细胞内的T3水平，在胎盘和胎儿保护发育中的组织避免暴露于高水平的活性甲状腺激素。既往的动物实验发现，甲状腺功能亢进时脑和皮肤中的D3活性增加，D3-mRNA的表达也明显增加；甲状腺功能减退或缺碘、缺硒时D3活性下降。甲状腺激素在脑发育过程中有重要的作用，D2、D3对不同发育阶段不同激素水平有严密的调节机制，所以对D2、D3的了解可以进一步深入研究甲状腺激素的作用，有助于了解碘水平异常、甲状腺激素异常导致的脑发育障碍的发病机理。5 主要研究内容及重点研究的关键问题及解决思路5.1 主要研究内容（1）恩施黑猪基因组DNA提取；（2）恩施黑猪前列腺素F2受体基因（PTGFR）扩增及多态性检测。5.2 重点研究的关键问题（1）建立前列腺素F2受体基因（PTGFR）突变位点检测方法5.3 解决的思路（1） 提取恩施黑猪基因组DNA，构建恩施黑猪基因组DNA池；（2） 设计引物，PCR扩增前列腺素F2受体基因（PTGFR）；（3） PCR产物序列测定，确定突变位点并寻找合适的核酸内切酶；（4） PCR-RFLPs检测前列腺素F2受体基因（PTGFR）多态性；6 完成毕业设计(论文)所必须具备的工作条件及解决的办法（1） 相关工具书：长江大学图书馆“自然科学类”工具书阅览室，读书馆阅览室以及电子阅览室查阅相关文献资料。（2） 计算机辅助设计：装有SAS统计软件，Word、Excel软件等。（3） 实验动物：1个地方猪种（恩施黑猪）和3个外引猪种（杜洛克、长白、大白）。（4） 实验器材及药品：实验用的各种微量元素、天平、烧杯、米尺、玻璃棒、试验田、电子秤等。（6） 试验进行的场地：长江大学动物科学院基础实验室。7 工作的主要阶段、进度与时间安排第一阶段：2013年9月2013年12月 查阅相关的参考资料并撰写开题报告 第二阶段：2014年 1月2014年 5月 进行相关的实验第三阶段：2014年 5月2014年 6月 试验数据的统计分析和比较，毕业论文撰写8 指导教师审查意见指导老师签名： 年 月 日