生物反应器体外构建组织工程化尿路肌性管腔.doc

生物反应器体外构建组织工程化尿路肌性管腔王 营，傅 强，赵仁淹(上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科，上海市 200233)文章亮点：1 理想的组织工程尿道替代物应具有良好的力学特性，静态培养的尿路肌性管腔强度不佳。2文章的创新性在于应用生物反应器体外动态构建组织工程化尿路肌性管腔，应用生物反应器引入力学因素明显改善了组织工程化尿路肌性管腔的组织结构和胶原分布，为应用组织工程技术修复尿道缺损提供了理想的组织替代来源。关键词：组织构建；组织工程；脂肪干细胞；生物反应器；聚羟基乙酸；动态力学刺激培养；静态培养；国家自然科学基金主题词：干细胞；组织工程；生物反应器，尿道；流式细胞术基金资助：国家自然科学基金资助项目(30973016)；上海市自然科学基金资助项目(09ZR1424100)摘要背景：理想的组织工程尿道替代物应具有良好的力学特性，足以承受长时间的尿液排泄冲击，而静态培养的尿路肌性管腔强度不佳。已有研究表明，力学刺激能够促进细胞生长和细胞外基质的分泌。目的：探讨生物反应器内构建组织工程化尿路肌性管腔的可行性。 方法：酶消化法获取脂肪干细胞，经体外培养和扩增后，流式细胞技术检测细胞表面抗原，将脂肪干细胞接种于聚羟基乙酸上，形成细胞-材料复合物，体外培养1周后，将其置于生物反应器内培养，实验组予以动态力学刺激培养；对照组为静态培养，先采用基础培养基培养3周，而后用成肌诱导培养液诱导4周，行大体观察及组织学检测。结果与结论：流式细胞仪检测细胞表面CD90，CD44，CD105表达率分别为99.42%，98.12%，93.27%；CD34，CD45表达率分别为4.92%和0.38%，实验组培养的肌性管腔色泽明亮，管腔圆润，免疫组化染色显示，细胞材料复合物在诱导4周后，细胞表达结蛋白和-平滑肌肌动蛋白阳性，细胞材料复合物胶原成分多。对照组构建的肌性管腔色泽暗淡，管腔轻度塌陷，细胞材料复合物胶原成分较少。提示脂肪干细胞复合聚羟基乙酸材料在生物反应器内动态培养可构建具有良好结构的尿路肌性管腔。王营，傅强，赵仁淹. 生物反应器体外构建组织工程化尿路肌性管腔J.中国组织工程研究，2014，18(2):165-170.Constructing a tissue-engineered muscular conduit of urinary tract in bioreactor Wang Ying, Fu Qiang, Zhao Ren-yan (Department of Urology, the Sixth Peoples Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China)王营，男，1987年生，山东省淄博市人，2013年上海交通大学毕业，硕士，医师，主要从事泌尿外科组织工程与干细胞技术研究。通讯作者：傅强，博士，主任医师，上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科，上海市 200233 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.001 http:/www.crter.org中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2014)02-00165-06稿件接受：2013-11-06Wang Ying, Master, Physician, Department of Urology, the Sixth Peoples Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, ChinaCorresponding author: Fu Qiang, M.D., Chief physician, Department of Urology, the Sixth Peoples Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, ChinaAccepted: 2013-11-06AbstractBACKGROUND: Ideal tissue-engineered urinary tract should have good mechanical properties to bear long-term attack of urine and excretion. Muscular conduit of urinary tract in static culture exerts poor strength. It is reported that mechanical stimuli promote cellular growth and secretion of extracellular matrix. OBJECTIVE: To investigate the feasibility of constructing tissue-engineered muscular conduit of urinary tract in bioreactor.METHODS: Adipose-derived stem cells were harvested by collagen enzyme method. After series culture and expansion in vitro, flow cytometric analysis was carried out to detect the immunophenotypes of adipose-derived stem cells. Then the cell-polyglycolic acid complex was constructed by seeding adipose-derived stem cells on polyglycolic acid fibers. After 1 week of in vitro culture, cell-polyglycolic acid complex was cultured in a bioreactor. The experimental group was subjected to pulsatile stimuli, while the control group was cultured in static state. After 3 weeks of in vitro culture in basic medium, the cell-polyglycolic acid complex was induced in the induced culture medium for 4 weeks, and then engineered tissue was examined both grossly and histologically.RESULTS AND CONCLUSION: Flow cytometry demonstrated that the adipose-derived stem cells expressed CD90 (99.42%), CD44 (98.12%) and CD105 (93.27%), but not CD34 (4.92%) or CD45 (0.38%). In the experimental group, tissue-engineered muscular conduit of urinary tract appeared bright color with a round lumen. Immunohistochemical staining showed that after cell-polyglycolic acid complex was induced for 4 weeks, the cells expressed desmin and -smooth muscle actin. More collagen was found in the complex. In contrast, the control group appeared pale surface and its lumen collapsed slightly. Less collagen was in the complex. Tissue-engineered muscular conduit of urinary tract with good structure can be constructed in a bioreactor.Subject headings: stem cells; tissue engineering; bioreactor, urinary tract; flow cytometryFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 30973016; Shanghai Natural Science Foundation, No. 09ZR1424100Wang Y, Fu Q, Zhao RY. Constructing a tissue-engineered muscular conduit of urinary tract in bioreactor. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(2):165-170.0 引言 Introduction先天及后天性的原因导致的尿道缺损是泌尿外科较为常见的疾病，需要进行相应的修复与重建。单纯的尿道狭窄切除后端端吻合仅对距离较短的尿道缺损治疗效果较好，而对于复杂的长段尿道缺损，往往需要相应的替代材料进行修复重建，目前临床上常采用生殖器皮瓣、膀胱黏膜、口腔黏膜等多种替代组织进行尿道重建治 疗1-5，但对于多次尿道修复治疗失败的患者，由于其局部可替代尿道的组织已被利用，因此治疗较为棘手。组织工程技术的运用将为解决这一难题提供有效的方法，组织工程尿道修复重建的主要内容包括3个方面：种子细胞、生物支架材料和组织工程尿道的构建。文章选用脂肪干细胞作为组织工程尿路肌性管腔的种子细胞来源，利用脂肪干细胞的多分化潜能，同时应用人工合成的可降解高分子生物材料聚羟基乙酸作为脂肪干细胞的复合支架，探讨在生物反应器内诱导培养构建组织工程化尿路肌性管腔，为组织工程技术在尿道修复重建中的应用提供理论基础。1 材料和方法 Materials and methods 设计：细胞材料生物学水平，对比观察动物实验。时间及地点：于2011年6月至2012年6月在上海市组织工程重点实验室完成。材料：生物反应器体外构建组织工程化尿路肌性管腔实验的主要试剂和仪器来源试剂和仪器SAFC Biosciences，美国Hyclone，美国Gibco，美国上海市组织工程重点实验室Sigma，美国Gibco，美国eBioscience，美国BD，美国Abcam，英国Sigma，美国Dako，美国Nikon，日本Philips，荷兰胎牛血清低糖DMEM培养液0.25%胰酶PBS溶液5-氮杂胞苷马血清PE-CD90,FITC-CD44,PE-CD34, APC-CD45FITC-CD105一抗：兔抗鼠结蛋白、兔抗鼠-平滑肌肌动蛋白二抗：FITC标记的羊抗兔二抗EnVision TM Peroxidase Rabbit倒置相差显微镜XL-30 ESEM型扫描电镜实验动物：毕格犬6只，6月龄，体质量8 kg，雄性，由上海交通大学附属第六人民医院动物实验中心提供，实验动物机构许可证号SYXK(沪)2011-0128。聚羟基乙酸材料：购自美国Albany International Research Company Inc公司。聚羟基乙酸材料是结构最为简单的线性脂肪族聚酯，脂肪族结构单元通过易水解的酯键连接形成聚酯的主链，而生物体内酸、碱或酶能够促进生物可降解聚酯的水解，最终形成CO2和H2O，生物相容性良好。实验方法：脂肪干细胞的分离、培养6：无菌条件下取犬一侧腹股沟脂肪组织，将脂肪组织先后置于氯霉素与PBS中反复冲洗，剪刀剪碎并转移至50 mL离心管中，加入0.1%型胶原酶37 震荡消化1 h，200目滤网滤除组织碎片，收集滤液，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，培养液重悬细胞后计数，接种于直径100 mm的培养皿中，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 、体积分数5%CO2培养箱内培养。流式分析：将处于对数生长期的原代脂肪干细胞作流式细胞检测，酶消化后调整细胞浓度为1109 L-1，流式细胞仪检测脂肪干细胞相关抗原CD90，CD44，CD105以及CD34，CD45，分析干细胞相关抗原的表达率，排除造血细胞的污染。 脂肪干细胞与材料复合物的复合：收集第1代脂肪干细胞，细胞总数为2107，离心弃去上清，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，均匀接种于卷在硅胶管上的2 cm1 cm1 mm未编织聚羟基乙酸上，置于培养箱内，每15 min旋转聚羟基乙酸材料90，4 h后加入含体积分数10%胎牛血清DMEM培养液，每天更换培养液，1周后光镜、扫描电镜下观察细胞外基质的分泌情况。生物反应器内动态培养：生物反应器包括反应槽、集液瓶、蠕动泵，医用硅胶管，经连接组装后置于培养箱内，使用前高压蒸汽消毒，整个回路提供细胞材料复合物培养的场所以及实现对复合物进行力学刺激。体外培养1周后的细胞材料复合物植入生物反应器的反应槽中进行动静态培养，实验组将卷在硅胶管上的细胞材料复合物接于反应槽动态培养接口，对照组将其接于反应槽静态培养接口，参数设定：搏动频率为75次/min7，从0开始每日渐增，先使用含体积分数10%胎牛血清DMEM培养液培养3周，之后采用含10 mol/L 5-氮杂胞苷、体积分数5%马血清和体积分数5%胎牛血清的DMEM培养液诱导培养，每7 d换1次液，培养4周后取材，行大体及组织学检测。主要观察指标：组织工程化尿路肌性管腔的检测：将培养8周的组织工程化尿路肌性管腔取出，大体观察其管腔、色泽与弹性等指标，苏木精-伊红染色与Masson染色分别显示诱导的成肌细胞及胶原分布，石蜡切片免疫组化法检测成肌细胞特异性抗原结蛋白与-平滑肌肌动蛋白。2 结果 Results2.1 脂肪干细胞的培养与鉴定 原代培养的脂肪干细胞24 h后见少量细胞贴壁，呈小多角形、大小不一，培养四至五天可达80%融合，细胞形态较为一致、呈集落样生长，将原代处于对数生长期细胞行干细胞相关指标CD90，CD44和CD105流式鉴定，行CD34和CD45流式鉴定排除造血细胞污染。结果显示，CD90，CD44和CD105表达率为99.42%，98.12%和93.27%；CD34和CD45表达率为4.92%和0.38%，符合脂肪干细胞的表型标记。2.2 细胞-材料复合物形态学观察 脂肪干细胞种植于聚羟基乙酸材料，24 h后细胞与聚羟基乙酸材料黏附牢固，相差显微镜下观察，脂肪干细胞向聚羟基乙酸纤维两级伸展，接种1周后可见细胞分泌的基质将聚羟基乙酸纤维之间的空隙充满，形成膜状物，扫描电镜示聚羟基乙酸材料包裹于细胞分泌的基质中(图1)。2.3 细胞-材料复合物大体观察 细胞-材料复合物培养 8周后，实验组与对照组均可见围绕硅胶管有类似尿道的肌性管腔结构形成，其直径6 mm，长10 mm，厚1 mm。实验组抽去硅胶管后，新生组织维持管腔结构，色泽光亮。对照组抽去硅胶管后，新生组织管腔结构轻度塌陷，色泽暗淡(图1)。2.4 细胞-材料复合物组织学观察 对照组可见构建组织中脂肪干细胞诱导的成肌细胞排列不均匀，其间有还未完全降解的聚羟基乙酸材料，胶原成分较少，并且诱导的成肌细胞在构建组织中不均匀表达结蛋白和-平滑肌肌动蛋白(图2)。DCBA图1 脂肪干细胞-聚羟基乙酸材料复合物的形态学及大体观察结果Figure 1 Morphological and gross observation of adipose-derived stem cell-polyglycolic acid complex 图注：(1) 图中A为倒置相差显微镜示，脂肪干细胞向聚羟基乙酸纤维两级伸展，接种1周后可见细胞分泌的基质将聚羟基乙酸纤维之间的空隙充满，形成膜状物(40)。 (2) 图中B为扫描电镜示聚羟基乙酸材料包裹于细胞分泌的基质中(300)。 (3) 图中C为静态培养对照组管腔结构轻度塌陷，色泽暗淡。 (4) 图中D为动态力学刺激培养组新生组织维持管腔结构，色泽光亮。ADBC图2 静态培养的组织工程化尿路肌性管腔组织学染色观察结果(200)Figure 2 Histological staining of tissue-engineered muscular conduit of urinary tract cultured in static state (200)图注：(1) 图中A为苏木精-伊红染色，聚羟基乙酸材料大部分降解。(2) 图中B为Masson染色，较少的胶原纤维分布。(3) 图中C为结蛋白免疫组化染色，成肌细胞在构建组织中不均匀表达结蛋白。(4) 图中D为-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色，成肌细胞在构建组织中不均匀表达-平滑肌肌动蛋白。 DABC图3 动态力学刺激培养的组织工程化尿路肌性管腔组织学染色观察结果(200)Figure 3 Histological staining of tissue-engineered muscular conduit of urinary tract cultured in dynamic state (200)图注：(1) 图中A为苏木精-伊红染色，聚羟基乙酸材料完全降解。(2) 图中B为Masson染色，较多的胶原纤维分布。(3) 图中C为结蛋白免疫组化染色，成肌细胞在构建组织中均匀表达结蛋白。(4) 图中D为-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色，成肌细胞在构建组织中均匀表达-平滑肌肌动蛋白。 实验组可见构建组织中脂肪干细胞诱导的成肌细胞排列较均匀，聚羟基乙酸材料降解完全，胶原成分较多而密，免疫组化证实实验组诱导的成肌细胞在构建组织中均匀表达结蛋白和-平滑肌肌动蛋白(图3)。3 讨论 Discussion尿道下裂和不同原因引起的尿道狭窄是泌尿外科常见的疾病，采用自体组织重建尿道是目前临床上主要的治疗方法，但可供移植的同源性皮瓣或黏膜组织来源有限，限制了其大面积的取材应用，组织工程技术的发展为尿道重建提供了新的有效的选择，美国学者Atala等8采用膀胱黏膜下层修复4例传统手术治疗失败的尿道下裂，新建尿道长度为5-15 cm，术后1年尿道造影显示尿道连续无狭窄，组织学证实重建尿道表现为典型的尿路上皮，该研究为应用组织工程技术修复尿道缺损的临床应用开辟了新的篇章。尽管采用单纯生物材料以补片的方式进行尿道修复重建已取得较好的效果9-10，但如果尿道损伤较大甚至闭锁，单纯的全管状材料修复，疗效不佳11。采用体外种子细胞复合生物材料进行尿道修复可明显改善术后的疗效12。脂肪组织中存在具有多向分化潜能的干细胞，称之为脂肪干细胞，已经证明脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞有类似的多向分化潜能和自我更新能力13-15，与其他成体干细胞相比，脂肪干细胞来源丰富，取材简单，从而可能作为组织工程新型的种子细胞用于组织的修复重建。符伟军等16采用间接共培养的方法将脂肪干细胞向尿路上皮细胞诱导，培养7 d后，脂肪干细胞呈现尿路上皮细胞样形态，2周后免疫荧光检测证实，40%-50%的脂肪干细胞表达尿路上皮细胞标记物，该研究表明脂肪干细胞通过间接共培养的方法可诱导为尿路上皮细胞，为泌尿系组织工程种子细胞的来源提供了可能。尽管脂肪干细胞诱导为平滑肌细胞的研究目前并未广泛开展，但国外研究学者已经尝试在培养液中加入某些化学因子来诱导脂肪干细胞表达平滑肌细胞的标记物，Rodriguez等17采用平滑肌诱导培养液诱导脂肪干细胞，6周后应用RT-PCR检测显示脂肪干细胞表达平滑肌细胞标记物阳性，免疫组化和荧光检测证实诱导的脂肪干细胞表达平滑肌细胞特异性的-肌动蛋白、钙结合蛋白、肌球蛋白重链增加，并且脂肪干细胞诱导的平滑肌样细胞在药物试剂的作用下表现为收缩和舒张的能力。以上研究表明，脂肪干细胞可作为种子细胞的来源应用于泌尿系组织工程的修复重建。研究证实脂肪干细胞在一定的诱导条件下可以向中胚层来源的不同组织类型细胞分化，如软骨细胞、成脂细胞、成骨细胞和成肌细胞18-22，本实验旨在研究犬脂肪干细胞的分离培养方法及如何将其诱导分化为成肌细胞，以期为构建组织工程化尿路肌性管腔提供简单、有效的成肌细胞来源。脂肪干细胞是否具有干细胞的特性是其能否作为尿道组织工程种子细胞的重要依据，通过对脂肪干细胞相关CD分子的检测来证明其干细胞特性。结果显示原代脂肪干细胞 CD90，CD44和CD105表达率为99.42%，98.12%和93.27%，复合干细胞的特点23-25，CD34和CD45表达率为4.92%和0.38%，可排除造血细胞来源的可能26-27，检测结果显示培养的细胞具有干细胞特性可满足向成肌细胞诱导分化的需要。理想的尿道组织工程支架材料，应具有良好的生物相容性，聚羟基乙酸材料在生物安全性和可靠性方面都能满足基本要求，使其在医学领域有着广泛的应用，聚羟基乙酸材料是结构最为简单的线性脂肪族聚酯28，脂肪族结构单元通过易水解的酯键连接形成聚酯的主链，而生物体内酸、碱或酶能够促进生物可降解聚酯的水解，最终形成二氧化碳和水。Bazeed等29应用人工合成生物材料聚羟基乙酸修复长3.0-4.0 cm的犬尿道缺损，术后2周犬自主排尿，组织学检查，术后2个月支架材料表面覆盖完整尿路上皮，修复段尿道周围未见炎性反应，植入体内的人工合成聚羟基乙酸材料在术后3个月溶解，修复段尿道管腔未见明显狭窄征象。Olsen等30采用聚羟基乙酸和聚-羟基丁酸的复合材料修复重建长约4 cm的犬尿道缺损，术后8-12个月，修复段尿道吻合口未见狭窄，组织学观察显示修复段尿路上皮再生情况良好，周围未见明显的炎性反应。研究表明聚羟基乙酸材料支持尿路细胞黏附、增殖，是构建组织工程尿道较为理想的生物合成材料31。理想的组织工程尿道替代物应具有良好的力学特性，足以承受长时间的尿液排泄冲击，而静态培养的尿路肌性管腔强度不佳，已有研究表明，力学刺激能够促进细胞生长32，使构建组织保持一定的弹性张力33，考虑到力学因素对改善构建组织力学特性的重要性，本文应用生物反应器体外动态构建组织工程化尿路肌性管腔，生物反应器是一种应用生物力学因素，模拟尿液蠕动作用，用于体外构建组织工程化尿路肌性管腔的装置，循环培养液通过硅胶管的膨胀变化对卷在其外周的细胞-材料复合物予以动态力学刺激，克服了构建组织由于液体直接冲刷作用而产生变形的缺陷。该装置有利于促进细胞定向分布及组织的形成34，国外Niklason等35证实搏动的张力可增加细胞-材料复合物中胶原含量，从而改善构建组织工程化血管的力学强度，Engbers-Buijtenhuijs等36研究显示，较静态培养，在生物反应器内搏动性刺激下，支架材料上的平滑肌细胞数量明显增加，细胞在支架材料上有更均匀的分布，有更多基质胶原的表达。经动态培养构建的组织工程化尿路肌性管腔色泽光亮，管腔圆润，组织学证实构建的组织聚羟基乙酸支架材料降解完全，有效的避免残留生物材料植入体内后可能引起的机体炎性反应37-38，同时动态构建的尿路肌性管腔细胞分布均匀，胶原致密，间接反映了其较好的力学特性。作者这次实验选用脂肪干细胞构建组织工程化尿路肌性管腔，细胞来源丰富，取材培养简便，分裂增殖能力旺盛，且具有多向分化潜能，将其与聚羟基乙酸支架材料复合在静态培养条件下诱导培养，免疫组化证实所构建的组织工程化尿路肌性管腔中脂肪干细胞成功诱导为成肌细胞，但诱导的成肌细胞在构建组织中分布不均匀，而采用生物反应器进行动态诱导培养的细胞-材料复合物，所诱导的成肌细胞在构建的组织工程化尿路肌性管腔结构中分布均匀，诱导效果显著，所构建的组织工程化尿路肌性管腔更加成熟。实验证实力学因素在组织工程化尿路肌性管腔构建过程中的重要作用，但构建的组织工程化肌性管腔面缺乏尿路上皮细胞的复合，与真正意义上的尿道组织仍有差距，因此构建出完整组织结构的组织工程化尿道修复尿道缺损，观察体内转归情况及尿道修复效果将是进一步探讨的重点。作者贡献：第一作者负责实验设计与实施，第二作者负责实验指导，第三作者负责试剂订购，由第一作者撰写成文，通讯作者审校。 利益冲突：文章及内容不涉及相关利益冲突。伦理要求：实验过程中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的关于善待实验动物的指导性意见。学术术语：生物反应器-是一种应用生物力学因素模拟尿液蠕动作用，用于体外构建组织工程化尿路肌性管腔的装置，循环培养液通过硅胶管的膨胀变化对卷在其外周的细胞-材料复合物予以动态力学刺激，克服了构建组织由于液体直接冲刷作用而产生变形的缺陷，生物反应器装置有利于促进细胞定向分布及组织的形成。作者声明：文章为原创作品，无抄袭剽窃，无泄密及署名和专利争议，内容及数据真实，文责自负。4 参考文献 References1 Rehder P, Glodny B, Pichler R, et al. 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