基因工程第三章基因工程的常规技术.doc

第三章 基因工程的常规技术第一节 凝胶电泳技术凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。 用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。 本节主要介绍琼脂糖凝胶电泳技术。一、DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 仪器 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪药品 Agarose、 TAE buffer、EB（溴化乙锭）上样缓冲液（6X）0.25% 溴酚蓝、0.25%二甲苯氰醇、40%蔗糖；水溶液4保存。二、琼脂糖凝胶电泳基本原理在电场的作用下，带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。 DNA分子的迁移速度与其分子质量的对数值成反比关系。 当用EB对DNA样品染色时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧光结合物，荧光的强度与DNA含量成正比，如果用DNA片段的标准品作电泳对照，就可以估计出待测样品的分子量大小和浓度。三、琼脂糖凝胶电泳的影响因素除样品DNA本身的大小外，琼脂糖凝胶电泳的分辨能力与胶的浓度、缓冲液、电压等有很大关系。琼脂糖凝胶电泳的参数缓冲液：TAE（醋酸缓冲液）、TBE （硼酸盐缓冲液） 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：1g，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。 能看到0.05 g的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比。第二节 分子杂交技术所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 核酸杂交技术主要有Southern杂交、Northern杂交和菌落原位杂交等。一、探针与探针标记 杂交的主要目的是为了检测出同源DNA序列，而为了达到这一目的，必需要有标记的探针。 带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。 使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。1.切口平移标记 用一定浓度的DNaseI在双链DNA的一条链的有限位置上打开切口。 利用DNA聚合酶I的5 3的核酸外切酶活性将DNA一条链上的核苷酸一个一个的切除，同时暴露出另一条单链DNA。 以这条单链DNA为模板，利用DNA聚合酶I的5 3的DNA聚合功能把一个一个带有标记的dNTP合成上去。2.随机引物标记 能与任何DNA模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段叫随机引物。 DNA聚合酶Klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。二、Southern杂交是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。 杂交步骤：1.酶切2.电泳3.转膜4.杂交5.显影三、Northern杂交1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与Southern印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northern印迹技术（Northern blotting）。 Southern杂交和Northern杂交的主要差别：1.对象不同（DNA/RNA）2.DNA在凝胶电泳分离后，用碱处理变性，形成单链。 RNA一般是进行变性电泳，在分离RNA的同时消除二级结构。 RNA变性电泳方法主要有甲醛变性电泳、羧甲基变性电泳和乙二醛变性电泳三种。四、Western杂交Western blotting是用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素膜或其它支持物上，然后同放射性同位素标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术广泛用于基因在蛋白质水平上的表达研究。五、菌落原位杂交也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。 是直接菌落或噬菌斑为对象来检测重组子的技术。第三节 PCR技术聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的方法始于20世纪70年代早期，由Khorana和他的同事最先提出的建义。 在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。一、PCR技术的基本成分PCR的成分包括：待扩增的模板、引物、DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸的混合物以及反应缓冲液。模板：模板是含有待扩增序列的DNA或从mRNA反转录来的cDNA。PCR的引物：是指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。引物的设计原则：1.引物碱基GC含量以45%55%为宜。 2.其长度通常在1530个核苷酸之间。 3.Tm值应高于55。 4.PCR扩增的长度一般：腺嘌呤(A)的N3 410倍 在六氢吡啶的作用下，从脱氧核糖上移去2个磷酸分子，使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂。化学修饰法的优点：1. 不需要体外酶切；2. 只要有末端标记，无论单双链都可用来测序。 至少能测出250个bp限制因素：测序胶的分辨率三、DNA测序分析的自动化用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作荧光剂，预先标记M13引物DNA5-末端，按标准的双脱氧链终止法同引物进行反应，用聚丙烯酰胺电泳分析。在电泳过程中，用激光激发电泳的片断产生荧光，被荧光感受器接受，最终转换成电信号，被计算机读出，或打印出来。