纳米医药 第12章-纳米生物医学传感原理与应用.doc

第12章纳米生物医学传感原理与应用12.1 引言纳米技术（nanotechnology or nanotechnique）包括纳米材料、纳米器件、纳米结构设计和加工组装、纳米机器以及相应的检测表征技术和方法，因此“纳米”（nano-）不仅仅局限于狭义的空间尺度上的意义，而是一种全新的思维方式和认识方法、研究手段和应用技术。生命过程动态生化信息的获取与解析，是认识生命现象和规律（包括生理、病理、药理等）以及疾病诊断和预后等的基础。由于生命过程研究的特殊性，需要发展能适应生物活体微区、原位、实空分辨、动态、超灵敏（单分子）分析的新原理和新方法。纳米科技的兴起为更好地获取生化信息特别是动态过程生化信息展露出诱人的发展前景。利用纳米粒子尺寸远远小于组成生命体的基本构造单元细胞的特点，借助纳米粒子标记的生物探针并结合其它示踪技术如荧光标记技术或酶标技术等，可望将研究的“触角”深入小到细胞甚至亚细胞层次，实现原位、实时、高选择性研究单个细胞生命过程的目的，为生命过程研究和重大疾病早期诊断提供适用的新方法。纳米材料和技术应用于生物传感和医学检测与诊断领域，尽管才十来年的历史，但已取得了许多令人鼓舞的成就。随着扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope, SPM），如扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscope, STM）、原子力显微镜（Atomic force Microscope, AFM）、扫描近场光学显微镜（Scanning near-field optic microscope, SNOM）等一系列高新科技仪器方法的应用，使得采用纳米技术的纳米生物医学传感技术近年来发展非常迅速，人们在纳米尺度甚至单细胞内单分子水平上获取生命过程生物化学信息已成现实。纳米生物医学传感技术已成为纳米科技领域最引人注目的、最有生命力的发展方向之一。12.2 生物传感原理与器件12.2.1 生物传感原理生物化学传感技术是生物医学领域中主要的分析检测技术之一，是利用生物分子极强的特异性识别的原理进行生物组分（包括核酸、蛋白质、酶、糖类、各种生物活性小分子、甚至细胞、组织等）以及能被生物组分识别的无机物的检测分析的技术。基于生物分子识别原理所设计制作的检测器件即生物传感器，是能选择性、连续可逆感受并传递、处理生物化学信息的系统装置。例如，葡萄糖传感器便是利用葡萄糖氧化酶（GOD）能从含有多种糖分子的混合溶液中，高选择性地识别出其中的葡萄糖分子并将其氧化成葡萄糖酸内酯，其识别反应信息通过换能器转换成可测量的物理信号而进行分析检测。12.2.2 生物传感器基本构成传统的生物传感器一般由感受器（Receptor）、换能器 (Transducer) 和检测器 (Detector)三部分组成。图12-1给出电化学生物传感器的示意图。试 样(生物分子识别组分)感受器生化信息换能器(电极)电信号（电流、电势、电导）导）检 测 器处理结果显示图12-1 电化学生物传感器示意图1感受器，又称敏感器或分子识别元件，其主要功能是进行生物化学分子识别。分子识别（Molecular recognition）基于分子间的特异相互作用，其作用力主要有氢键、静电、疏水等类型。分子识别过程有时仅借助一种作用力，有时是多种作用力协同作用的综合结果，往往具有很高的选择性，犹如钥匙与锁的匹配关系。具有分子识别功能的生物组分构成感受器的核心或关键部分，通常要求其具有很高的灵敏度和选择性。常见的生物功能组分有生物酶、组织、抗原、抗体、结合蛋白质、植物凝血素、激素受体、微生物和DNA等。表12-1列举了常用的几种生物分子识别物质。表12-1 几种常用的生物分子识别物质1分子识别元件生物活性材料酶膜全细胞膜组织膜细胞器膜免疫功能膜DNA探针各种酶类细菌，真菌，动植物细胞动植物组织切片线粒体，叶绿体抗体，抗原，酶标抗原等特定基因或其部分序列2换能器的主要功能是将感受器感受到的生物化学信息转换成易检测的物理化学信号，如光、电、磁、热和浓度等。表12-2列举了一些生物化学信息所需对应选择的换能器的种类。值得一提的是纳米技术给生物传感器分子识别信息的高效转换检测开辟了新的发展空间。许多基于纳米放大技术的生物传感器已见报道2-8，相关内容随后将作进一步的介绍。表12-2 生物化学信息和换能器的选择1生化信息换能器的选择离子活度变化质子活度变化气体分压变化热效应光效应色效应质量变化电荷密度变化溶液密度变化离子选择性电极，阻抗计离子选择性电极，场效应晶体管气敏电极，场效应晶体管热敏元件光纤、光敏管、荧光计光纤、光敏管压电元件阻抗针、导纳、场效应晶体管表面等离子共振3检测器，将得到的物理化学信号进行检测、记录处理和显示结果。总之，生物传感器就是利用生物功能组分与被测物特异性结合所给出的生物化学信息，通过换能器转换并由检测器处理和显示，来对被测物进行分析检测。传感器的性能主要取决于感受器的选择性、可逆性、稳定性，换能器的灵敏度以及响应时间，检测器的信号采集、处理能力等。12.2.3 生物传感器分类生物传感器的种类有很多，分类方法也各不相同1。若按生物分子识别组分的不同可分为：酶传感器、组织传感器、免疫传感器、微生物传感器、基因传感器等等。酶传感器：其原理是利用酶在生化反应中特殊的催化作用，将糖类、醇类和有机酸类等迅速氧化或分解，所产生的变化转换成光、电等信号，进行检测分析。各种酶传感器已达几十种。表12-3列举出其中的几种。表12-3 几种酶传感器测定对象酶检测电极葡萄糖尿素尿酸乳酸胆固醇中性脂质青霉素苦杏仁苷硝基化合物亚硝基化合物葡萄糖氧化酶尿酶尿酸酶乳酸氧化酶胆固醇氧化酶蛋白脂酶青霉素酶苦杏仁苷酶硝基还原酶-亚硝基还原酶亚硝基还原酶O2, H2O2, I2, pHNH3, CO2, pHO2O2O2, H2O2pHpHCN-NH+4NH3组织传感器：它直接利用天然动植物组织和器官中的酶，本质上也是酶传感器。这些酶处于组织器官的天然环境中，非常稳定。所制备传感器不仅取材容易，价格低廉，而且稳定性好，使用寿命更长。表12-4中列举出几种组织传感器。表12-4 几种组织传感器9测定对象组织检测电极谷氨酰胺腺苷AMP鸟嘌呤过氧化氢谷氨酸多巴胺丙酮酸尿素尿酸磷酸根/氟根酷氨酸半胱氨酸猪肾鼠小肠粘膜细胞兔肉兔肝，鼠脑牛肝，莴苣子，土豆黄瓜香焦，鸡肾稻谷杰克豆，大豆鱼肝土豆/葡萄糖氧化酶甜菜黄瓜叶NH3NH3NH3NH3O2CO2NH3CO2NH3，CO2NH3O2O2NH3微生物传感器：它们可分为两种类型：一是利用微生物所含酶的催化作用，称为酶源型；另一类是利用好氧微生物在同化底物时的耗氧呼吸作用，称为呼吸型。表12-5列举出几种微生物传感器。免疫传感器：它利用抗原-抗体之间的高选择性分子识别进行抗体或抗原分析。例如人绒毛膜促性腺激素（HCG）传感器、a-甲胎蛋白（AFP）免疫传感器等。基因传感器：是一种常用的DNA检测技术，其工作原理很简单：将单链DNA（ssDNA）探针固定在载体表面，基于DNA的碱基配对原理与互补的靶序列杂交，再利用各种换能器放大杂交信号进行基因的检测分析10。若按换能方式，生物传感器主要可分为电化学生物传感器（Electrochmical biosensor）、光学生物传感器(Optical biosensor)、热生物传感器（Thermal biosensor）、压电生物传感器（Piezoelectric biosensor）等几大类。电化学生物传感器建立在电化学与电测量技术基础之上，并将生物化学信息以电势、电流和电导等电学参量表达出来，主要有电位型和电流型；光学生物传感器则是建立在光谱化学与光学测量技术基础之上，并将生物化学信息以光强或特征光谱表达出来；热生物传感器基于生物化学反应所伴随的热效应的测量；压电生物传感器则基于压电晶体振荡频率随分子识别过程的质量变化而改变的原理进行传感。表12-5 几种微生物传感器9测定对象微生物检测电极葡萄糖同化糖乙酸氨甲醇制霉菌素变异原亚硝酸盐维生素B12甲烷BOD维生素B1甲酸头孢菌素烟酸谷氨酸赖氨酸尿酸L-天冬氨酸荧光假单胞菌乳酸发酵短杆菌芸苔丝孢酵母硝化菌未鉴定菌芸苔丝孢酵母枯草杆菌硝化杆菌大肠杆菌鞭毛甲基单胞菌丝孢酵母，地衣芽孢杆菌发酵乳杆菌酪酸梭菌费氏柠檬酸细菌阿拉伯糖乳杆菌大肠杆菌大肠杆菌芽孢杆菌大肠杆菌O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2燃料电池燃料电池pHpHCO2CO2O2NH3若按生物分子识别组分与被测物的结合性质，生物传感器又可分为催化型生物传感器和亲和型生物传感器两大类9。前者利用酶的选择性和催化性，如酶传感器，组织传感器，微生物传感器等，它检测的是整个反应动力学的总效应；后者则利用分子间的特异亲和性，如免疫传感器，受体传感器，基因传感器等，它检测的是反应热力学平衡的结果。催化型生物传感器是生物传感器早期发展的切入点，而亲和型生物传感器则是生物传感器今后的发展方向。不同的生物识别组分与不同的换能器组合，则构成不同类型的生物传感器。12.2.4 生物传感器的特点生物传感器具有选择性强、灵敏度高、分析检测速度快、仪器设备简单、操作使用方便、费用低廉等主要特点，因而广泛应用于生物化学分析、医学检测与诊断、司法医学，以及环境监测、卫生监督、生物医药和食品质量检验与控制、生产在线监控等许多领域。主要分析对象包括糖类、有机酸、氨基酸、核酸、蛋白质、抗原、抗体、激素、细胞、细菌、病毒、毒素以及环境污染物质等。其不足之处表现在重现性和稳定性较差，特别是长期存放的稳定性是使用中所面临的主要问题。12.2.5 分子识别组分固定化方法固定化是指将分子识别组分通过吸附、键合等方法固定在换能器表面，并保持其生物活性和稳定性，其主要目的是使分子识别组分在保持其生物功能的前提下，与换能器组装成传感器的探头。分子识别组分的固定化方法较多，主要有如下几种11：(1) 共价键合法生物分子识别组分与换能器（如电极）表面通过化学键结合而固定化。共价键合法一般分两步进行。第一步是换能器表面的活化预处理，以引入活性键合基团；第二步是进行表面化学连接，通过共价键合反应把经过修饰的分子识别组分固定到换能器表面。有时，根据具体情况还需采用逐步反应方法将换能器表面的键合位点延伸，然后再将识别组分共价固定。图12-2给出一种共价键合固定方法的实例。图12-2 DNA探针在换能器表面的一种共价键合固定化方法一般来说，共价键合固定化方法得到的分子识别敏感层较稳定，传感器使用寿命较长、重现性较好。缺点是，一些活化剂、交联剂往往难于得到，价格昂贵。另外，表面键合反应的产率有时较低，得到的分子识别敏感层的覆盖度较小，降低传感器的灵敏度。(2) 吸附法将分子识别组分吸附在换能器或修饰过的换能器表面；或者先吸附在分子筛等无机载体材料上，再固定到换能器表面。吸附法操作简单、方便，但活性组分常常易因吸附不牢固而在使用中流失，导致传感器的稳定性、重现性较差。在某些情况下，生物组分的活性会因吸附变性而丧失。(3) 包埋法将分子识别组分包埋在高分子材料中，制备成敏感膜，再与换能器结合。包埋法得到的分子识别敏感层的微观结构往往难于控制，导致不同批次传感器的一致性较差，由于敏感膜一般较厚，致使传感器的响应时间较长。但包埋法简便易行，生物分子识别组分的活性往往能得到很好的保持。(4) 自组装法基于分子自组作用，在换能器表面自然形成高度有序单分子层的方法称为自组装法（SAM法）。SAM 法制备分子识别敏感层时多利用巯基衍生的生物活性分子，通过其巯基与金表面的强烈相互作用而固定在以金为基底的换能器表面。图12-3 给出自组装法制备DNA敏感层的实例。Bard等12,13通过-SH在金表面的自组装和有序地吸附、反应(图12-3a)，制备出一层有序的直链烷基双膦酸铝膜，膜中含有金属中心离子Al3+，能与带负电的DNA链产生很强的静电相互作用，从而将单链DNA（ssDNA）或双链DNA（dsDNA）固定于电极表面，得到DNA传感器(图12-3b)。图12-3 自组装法制备DNA传感器SAM法得到的分子识别敏感层的表面结构高度有序、可控，有利于识别分子生物活性的保持。但巯基衍生的生物活性分子的制备较难，另外，巯基的长期存放稳定性不是太好，致使传感器的性能在使用中会有所下降。总之，上述不同固定化方法各有其优缺点，使用时应视不同的具体情况而定。采用不同固定化方法得到的分子识别敏感层/换能器界面，将直接影响生物传感器的性能与使用寿命。固定化技术作为生物传感器设计与制作中最关键的技术之一应予以足够重视。12.2.6 基因检测原理与标记方法1990年10月1日，美国向全世界宣布开始实施人类基因组计划（Human Genome Project, HGP），旨在发现人类所有的全部基因及其碱基对序列，以及它们在染色体上的确切位置、结构、表达调控方式以及变异，最终完全破译人类全部的遗传密码信息。这是继“曼哈顿”原子能计划和“阿波罗（Apollo）”登月计划之后，人类历史上的又一宏伟科学工程和历史壮举14。经过短短10年的卓越努力，提前5年基本完成原定于2005年10月完成的工作，并于2000年6月26日由美、日、英、法、德和我国科学家联合向全世界公布了人类基因组工作草图。人类基因组大约由3109个脱氧核苷酸对（碱基对）组成，其中约有2%的DNA为基因编码序列，共编码约46万个基因。人类基因遗传密码的基本破译，使人类第一次在分子水平上对自我有了进一步深入的认识，为揭开人类自身的生、老、病、死奥秘奠定了基础，并为在基因水平上诊断、治疗和预防疾病，有效延长人类寿命和提高生活质量创造了条件。绘制人类基因组工作草图是一项十分复杂的系统工程，成千上万具有不同学科背景的科学家参与了这一伟大工程。基因测序，毫无疑问离不开基因检测技术，包括相应的标记技术。下面将对基因检测原理与标记方法作一简要介绍。1. 基因检测原理1953年Watson和Crick提出DNA的双螺旋结构模型，即DNA分子是由腺嘌呤核苷酸（A）、鸟嘌呤核苷酸（G）、胞嘧啶核苷酸（C）和胸腺嘧啶核苷酸（T）四种核苷酸按一定的顺序排列而成，呈双螺旋结构（如图12-4 (a) 所示）。通常，一段含特定遗传信息的DNA序列称为基因。基因传递着支配生命活动的指令，一切生命活动（繁衍、进化、死亡等）均直接或间接地在基因控制之下。因此，研究各种生命现象的底蕴和机制时必然要在基因这一层次上寻找其原因，基因研究已融入生命科学的每一个分支学科，成为现代生命科学研究的核心内容。因此，基因检测也成为生物医学传感技术领域的重要研究内容。基因检测一般采用直接测序或杂交检测。直接测序采用在分子生物学中广泛使用的Sanger发明的双脱氧链终止法，其可靠性非常高，但较繁琐或设备昂贵。对于一般的基因检测来说，杂交法简单、方便，也可达到相应的要求，基因传感器（或DNA传感器）即是基于杂交法。尽管基因杂交检测的具体方式不尽相同，但其基本原理是相同的，即碱基配对（互补）原理，即AT，CG配对结合, 如图12-4(b)所示。杂交时，探针与靶序列之间通过Waston-Crick氢键形成双螺旋结构，由于这种双螺旋结构的形成（分子识别）具有极高的选择性，因此探针DNA能在含有多种非互补序列的混合物中识别出靶序列。大沟小沟10343.4HOC在磷酸酯键中C和N在碱基中PCC、N还原部位氧化部位图12-4 （a） DNA双螺旋结构 （b） 碱基配对（互补）根据检测核酸的种类和手段不同，核酸分子杂交检测可分为原位杂交（In situ hybridiztion）、斑点杂交（Dot hybridiztion）、Southerm杂交、Northerm杂交15等方法。根据反应介质差别又可分为：待测核酸序列与探针均游离在溶液中进行的液（均）相杂交和将待测核酸序列结合到固相载体上与游离在溶液中的探针分子进行杂交的固相（多相）杂交。 基因传感器一般采用固定核酸探针检测溶液中游离的待测核酸序列的固相杂交方法。顺便提一下，除核酸分子的杂交外，还有以抗原抗体、受体配体特异性结合反应为特征的Western杂交。目前，在基因传感器中，所谓的“三明治型（夹心式）”杂交检测的模式得到较普遍应用。具体做法是，将序列A（称为捕获探针）固定到换能器表面后，利用与B序列（待测序列）一端互补的探针序列C（称为检测探针）进行检测。图12-5 “三明治型（夹心式）”杂交检测基于杂交原理的基因碱基错配、基因缺失、变异等的检测在遗传学、免疫学、医学生理学、病理学和药理学等生物医学领域具有重要的意义。2基因检测的标记方法标记技术是将生物分子识别信息转换为潜在可测信号的技术，是生物医学传感技术中常用的重要支撑技术。由于生物分子特异性结合（识别）时，所产生的信号通常很微弱，因此需要用一些活性物质（称为标记物）来标记，以使信号放大，提高检测灵敏度，使待测物在很低的浓度下也能检测出来。生物学上早期的基因检测标记方法是放射法。标记物按其是否具有放射性可分为：放射性标记物与非放射性标记物两大类。前者主要有：32P、33P、35S、3H、131I、135I、14C等；后者主要有：荧光素、生物素、酶、地高辛、銪离子、联吡啶合钌、二茂铁等。放射性标记法的主要特点是：检测灵敏度高，可检测到10-14g10-18g被测物，常用来跟踪杂交过程。其主要缺点是有放射性，对生物体系有损害，并造成环境污染。因而正逐渐被非放射性标记法所取代。非放射性标记法是近年来迅速发展的一类标记方法，主要包括发光标记法、酶标记法和电活性物种标记法等几种。通常基因传感器采用的标记方法为非放射法。(1) 电活性物种标记法电活性物种标记法是电化学基因传感技术中常用方法。由于杂交过程的物理化学信号很弱，通常需要加入合适的杂交指示剂，进行信号的转换和放大，以便分析检测。电活性杂交指示剂（Hybridiazation indicator）是一类能与单链DNA和双链DNA以不同方式相互结合的化合物。杂交指示剂与DNA分子的非共价结合主要有三种基本模式16：静电结合，即电活性杂交指示剂通过非特异性的相互作用结合于带负电荷的DNA链的外部。 嵌插结合，即在碱基对之间嵌入平面的或几乎平面的电活性的芳香环系统。嵌插结合的作用力来自芳环的离域p体系与碱基的p体系间的p-p相互作用及疏水相互作用。而对于一些含有庞大取代基的分子，如吡啶环取代的卟啉分子在与DNA作用时，吡啶环取代基会尽量旋转以保持与母环的共平面，从而形成良好的堆积形状与DNA碱基嵌合。 沟结合，即电活性杂交指示剂与DNA的大沟或小沟的碱基对边缘直接发生相互作用。在杂交指示剂的供体基团与小沟中A的N3或T的O2这些受体间常常有氢键形成。除了利用非共价结合的电活性杂交指示剂转换DNA分子杂交识别信息外，在电化学基因传感器中，还常常采用电活性基团共价键合标记靶序列，或者引入另一标记有电活性基团（如二茂铁）的检测探针并采用“夹心式”检测模式来转换分子杂交信息，从而检测靶基因（靶序列）。图12-6是二茂铁标记的检测探针“夹心”法检测模式的示意图17。采用电活性杂交指示剂标记，其操作较简便，但灵敏度一般较低。电活性基团共价键合标记的灵敏度较高，但是，其探针难于合成，费用昂贵。电极表面捕获探针靶基因检测探针图12-6 采用电活性基团共价键合标记探针的“夹心式”检测模式(2) 发光标记法发光标记法主要包括荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、电致化学发光标记等。常用的发光标记物和标记法如表12-6所列。表12-6 几种发光标记物18标记物检测限(amol)检测方法标记物检测限(amol)检测方法FluoresceinCoumarinPhycoerythrinEuropium chelatePhthalocyanine compounds(PB630、PB670、PB710)CdSe/ZnS0.10.010.040.0010.10.0010.010.0010.01FFFFFFAcridinium esterAcridinium ThioesterPhenanthridinium esterLucifirinAlkaline phosphatase-d-Galacto-sidase0.030.0030.010.0010.000010.0002CLCLCLBLBLBL注：F：荧光法；CL：化学发光法；BL：生物发光法。虽然发光标记生物传感器的灵敏度较高，但是选择性、稳定性和重现性较差，探针或靶序列标记反应较复杂费时，价格也很昂贵。(3) 酶标记法一般是将酶标记在靶DNA上，直接通过与换能器表面的捕获探针杂交检测；也可用酶标记检测探针，采用“夹心式”杂交模式检测（如图12-5）。Zhou等19将光纤末端用氨基硅烷化试剂处理后，利用戊二醛交联固定NH2-ssDNA；氨基衍生的靶序列也通过戊二醛交联而标记上辣根过氧化物酶(HRP)，HRP催化H2O2-鲁米诺体系发光而进行检测。Peltier等20制备了一种夹心式酶标化学发光基因传感器。固定序列通过一端连有的毛地黄素而固定在吸附了抗毛地黄素的载体上，探针序列的一端则连有生物素，可结合碱性磷酸酶AP标记的抗生物素蛋白，AP可催化5-(2,4-二氟苯基)水杨酸磷酸酯水解产生5-(2,4-二氟苯基)水杨酸，再与Tb3+-EDTA形成三元荧光化合物。此法也可将生物素/抗生物素蛋白用于固定寡聚核苷酸，毛地黄素/抗毛地黄素用于连接探针序列与AP。Ma等21通过HS-ssDNA在Au表面形成自组装膜而将探针固定，与生物素修饰的靶序列杂交后，通过生物素结合AP标记的抗生物素蛋白，3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基)苯基-1,2-氧杂环丁烷（AMPPD）是AP的直接化学发光底物，AP可以切割AMPPD的磷酸基团使AMPPD分解发光从而进行检测。聚丙烯酰胺（PAA）-聚1-乙烯基咪唑（PVI）-锇（Os）聚合膜具有电化学活性，Heller等22,23先在玻碳电极上电沉积一层PAA-PVI-Os氧化还原膜，其中部分丙烯酰胺已经预先转化成丙烯酰肼，单链寡聚核苷酸5端的磷酸基团与水溶性碳二亚胺（EDC）反应活化后通过电泳接近电极表面，与电极上氧化-还原膜的酰肼的NH2反应而固定在膜上。靶ssDNA一端标记有辣根过氧化物酶（HRP）或大豆过氧化物酶（SBP），HRP和SBP均可催化H2O2的还原，探针与靶序列杂交后，通过H2O2还原电流检测靶序列。氧化还原膜充当电子中继体，酶活性中心与聚合膜上能随意移动的含Os(I/II)的支链发生碰撞而传递电子。此种传感器可分辨出18个碱基中含一个错配碱基的寡聚核苷酸。可见，酶标记技术总是与催化发光、催化电化学检测、催化显色等方法耦合联用，达到高灵敏度检测基因的目的。由于可很方便地增大催化反应的底物浓度，所以检测灵敏度可大幅度地提高。应该指出，选择何种标记物和标记方法需要综合考虑检测的目的与要求、特异性、灵敏度、标记和检测的难易程度等多种因素。理想的标记方法不会改变探针分子的理化特性，不影响探针分子与靶分子的特异结合，同时检测方法要灵敏、特异和简便。12.3 纳米技术与生物传感在生物医学领域，常常要求进行实时（Real time）、动态（Dynamic）、活体（In vivo）和原位(In situ)分析检测，而传统的生物传感技术受到一定的局限。随着现代电子技术、生物技术、特别是纳米技术的迅速发展，生物医学传感技术领域也日新月异，相继涌现出如纳米生物传感器、纳米生物探针、生物芯片等许多新的技术和方法。纳米材料和技术的引入，为研制灵敏度高、选择性好、使用寿命长、尺寸小的生物传感器件创造了新的机遇。例如，利用纳米粒的小尺寸可制备纳米生物探针及器件，实时、动态探测单细胞中单分子的运动规律及生化反应性能。利用半导体纳米晶粒的量子尺寸效应和表面效应制备的量子点可作为新型的荧光标记物，用于生物医学分析。利用纳米粒子的表面效应可对DNA杂交信息进行放大，制备出目视化基因诊断芯片。采用纳米结构设计与加工技术可研制出微米级甚至纳米级、具有多功能的仿生传感系统。显然，纳米技术在生物医学传感技术领域的应用前景是毋庸置疑的。纳米标记和放大技术应用于单分子、单细胞原位、实时、动态分析将是最具吸引力和发展潜力的前沿领域。生物医学纳米技术不仅可为基础生物学和基础医学研究提供新手段，而且还将在疾病早期诊断研究中发挥巨大作用。这是一个令人神往的崭新领域。12.3.1 相关纳米粒合成与制备ZnSCdSe用于生物传感器的纳米材料主要是纳米粒（简称纳粒）24。它们大体可分为3种类型：单一纳粒溶胶，如金、银、铂、二氧化硅、二氧化钛等纳粒溶胶；复合纳米粒, 它们由单一纳粒溶胶复（混）合而成，如Au-Ag、Au-SiO2、Pt-SiO2等；核/壳型结构（Core-shell type）纳粒，其特点是多层复合结构。内层（核）多为如荧光染料、半导体量子点、磁性材料、金属材料、药物和生物活性分子；外层（壳）多为 金、银、二氧化硅等无机材料和多糖、蛋白质等生物高分子材料，如图12-7所示。核/壳型纳粒制备所涉及的关键技术主要有：核/壳型纳米颗粒的成核技术、包壳技术、表面生物分子固定化修饰技术，以及纳米颗粒操纵技术等。多层结构具有多种功能。通常，-为改善纳米粒子的性能、满足不同的需要，必须对其表面进行适当的化学和生物功能化修饰。常用的生物功能化修饰剂有酶、核酸、抗体、激素等。图12-7 蛋白质修饰的ZnS包CdSe核-壳型纳米粒子结构示意图25纳米粒合成方法有很多，如反相胶束法、水热法、溶胶-凝胶法等。其中反相胶束法是最常用的一种方法。反相胶束法利用微乳液（Microemulsion）或称反相胶束（Reversed micelle）或微反应器（Microreactor）所提供的微小反应空间（场所）来合成制备纳米粒。微乳液是两种互不相溶液体在表面活性剂作用下形成的热力学稳定的、各向同性、外观透明或半透明、粒径1nm100nm的分散体系。在微乳体系中，用来制备纳米粒的一般是W/O型体系，该体系一般由有机溶剂、水溶液、表面活性剂、助表面活性剂4种组分组成26。油包水（W/O）微乳液的“水池”（Water pool）或称液滴（Droplet）为纳米级空间，以此空间为反应场合可以合成1nm100nm的纳米粒子，故称为反相胶束微反应器（Reversed micelle microreactor）或纳米反应器（namoreactor）。水核半径与体系中水和表面活性剂的浓度及种类有直接关系，若令=H2O/表面活性剂，则由微乳法制备的纳米粒的尺寸主要由值的大小决定。由于微乳液属热力学稳定体系，在一定条件下胶束具有保持特定稳定小尺寸的特性（即自组装特性），即使破裂也能重新组合，这类似于生物细胞的一些功能如自组织性、自复制性，因此又将其称为智能微反应器（Intelligent microreactor）。反相胶束微反应器制备纳米粒有如下特点27：由于反应物是以高度分散状态供给的，可防止反应物局部过饱和现象，从而使微粒的成核及长大过程能均匀进行，且可通过调节影响微反应器的外界因素而制备出较理想的单分散纳粒；另外，生成的纳粒可在“水池”中保持稳定状态，不会引起不必要的凝聚，使所制备的纳粒可稳定长期保存。再就微反应器本身而言，通过控制胶束及“水池”的形态、结构、极性、疏水性、粘度、酸度等，可望从分子规模来控制纳粒的大小、形态、结构乃至物体特异性。以下仅就生物传感中常用的几种纳粒的合成作简要介绍。1纳米金常用的单一纳米粒子有Au、Ag、TiO2、SiO2等，其中Au纳粒最常用。金纳粒具有制备简单、粒径均匀、化学性质稳定、亲和力强、生物相容性好、易于生物分子固定修饰等特点，因而广泛应用于纳米生物传感器。其合成和制备的具体方法有许多, 其中主要有：反相胶束法、水相合成法、晶种合成法等。（1）反相胶束法28：以正辛烷作油相，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）作表面活性剂，正丁醇作助表面活性剂。取正辛烷10mL，CTAB 1.2g，三次蒸馏水1mL。混合均匀后，滴加正丁醇至反应体系透明，即可制得反相胶束。一份反相胶束中为0.1mol/L HAuCl4水溶液；另一份反相胶束中为0.6mol/L NaBH4水溶液。将两份反相胶束迅速混合，常温下磁力搅拌2h即可制得金黄色透明状的纳米金溶胶。纳米金粒的直径（D）大小主要取决于反相胶束中水与表面活性剂的量的比值H2O/CTAB，因而可据此调控纳米颗粒的大小。（2）水相合成法29-31：所有的玻璃器皿均用王水处理，水冲洗后再用三次蒸馏水清洗，烘干备用。HAuCl4、柠檬酸钠及其它溶液均用三次蒸馏水配制，并经0.8 m的滤膜（Gelman Scientific）过滤。 在带有冷凝管的1 L圆底烧瓶中，加入500mL 1mmol/L的HAuCl4,强力搅拌并加热至滚沸，快速加入50mL 38.8mmol/L的柠檬酸钠，溶液由浅黄色变为红色，继续保持沸腾10min，然后移开加热源，继续搅拌15min，在溶液冷却到室温后，经0.8m滤膜过滤，即得纳米金。其粒径大约为（132）nm。 在带有冷凝管的1 L圆底烧瓶中，加入500mL 0.01%的HAuCl4，强力搅拌并加热至沸，再加入7.5mL 1%的柠檬酸钠，在25秒之内溶液变为蓝色，70秒之后又变为紫红色；继续沸腾10min，移走加热源，再继续搅拌15min，在溶液冷却到室温后，经0.8m滤膜过滤，即得纳米金。其粒径为（185）nm。纳米金的粒径可由加入的柠檬酸钠的量进行调节。（3）晶种合成法32,33：2.6nm胶体金的制备：室温下2023，将1mL 1%的HAuCL4加入到90mL水中，搅拌1min，再加入2mL 38.3mmol/L柠檬酸钠。1min之后，再加入1mL含0.075% NaBH4的38.8mmol/L的柠檬酸钠。再搅拌5min，即得2.6nm的胶体金。在4 黑暗处保存。 将0.01%的HAuCl4溶液加热至沸，搅拌下加入38.8mmol/L柠檬酸钠的同时加入一定量的上面制备的2.6nm的胶体金作为“晶种”。加热沸腾15min，之后继续搅拌10min，制备得到纳米金。通过改变加入“晶种”的量，可以得到不同粒径大小的纳米金。比利时的De Mey博士等人利用乙醚的黄磷饱和溶液、抗坏血酸或者柠檬酸钠将氯金酸（HAuCl4）水溶液还原，制备金纳米粒，粒径的尺寸范围是3nm40nm。另外，利用反应物的光分解或链锁反应特性也可以制备纳米粒，如用光照射HAuCl4微乳液，发生分解反应得到金纳粒产物。2. 复合纳米粒它们是由不同的元素或化合物构成的纳米粒。现列举几种复合纳米粒的制备方法。（1）ZnS: Mn纳米粒34：取适量的表面活性剂（S-80、T-60），正己醇和汽油，搅拌均匀，制得微乳液体系。充分搅拌，并向微乳液体系中滴加适当浓度的乙酸锌、乙酸锰、硫化钠水溶液，室温反应30min，制得ZnS: Mn纳粒的粒径约为3nm5nm。（2）Ni-Fe复合物纳粒35应用W/O型微乳液法制备纳米级超细铁-镍复合物。将含0.056mol/L FeCl2, 0.20mol/L NiCl2, 0.05mol/L DBS, 0.5mol/L水与45mL异戊醇和15mL正庚烷混合，电磁搅拌数分钟，得A液；将0.513mol/L NaBH4与25mL异戊醇和15mL正庚烷混合，电磁搅拌数分钟得B液。然后，将A、B液混合于三口烧瓶中，加10mL二甲苯，于水浴上通N2气减压回流1.5h。待二甲苯，水和其它有机物蒸出后，残余物用水和丙酮多次洗涤，去除悬浮物，剩余物离心分离，于80真空干燥。制得Ni-Fe复合纳粒。（3）ZnS:Cu纳米粒36将适量的S-80，T-60和正己醇加入到汽油中，电磁搅拌15min，再加入适量的去离子水或水溶液，搅拌30min后可得到稳定的微乳液，体系黄色透明。按100:1的摩尔配比分别将乙酸锌和乙酸铜水溶液加入到配制好的微乳液体系中，搅拌10min，然后向微乳液中滴加新配制的Na2S水溶液（Zn2+与S2-摩尔比为1:1），在电磁搅拌下反应30min，即可得到ZnS: Cu复合纳米粒子的胶束溶液。然后破乳，清洗，真空干燥，可得到ZnS:Cu纳粒。XRD表明纳粒粒径为3nm5nm，且为立方晶型结构。3量子点量子点（Quantum Dot, QD）37即半径小于或接近激子玻尔半径的半导体纳米晶粒。因其特有的量子尺寸效应、表面效应及光学性质，它们在发光材料、光敏传感器等方面有广阔的应用前景。尤其是B族与A族元素组成的量子点，简称为-型量子点（如CdSe、CdTe等）。它们具有特殊优良的可见光区荧光发射性质，因而有望成为一类新型的生化探针和生物传感器。-量子点的合成方法很多，根据所采用原料和工艺不同，大致可分为无机合成路线和金属-有机物合成路线。制备过程中产物的形成又可以分为快速成核和缓慢生长两个步骤，其中生长过程经历奥斯特瓦斯特成熟过程，即不稳定的小晶体逐渐溶解，并在较大的、更稳定的晶体上重结晶。常用的制备方法有溶胶-凝胶法、反相胶束法、水热法、模板法等。下面仅就几种重要的量子点的制备作简要介绍。（1）单一量子点CdS和ZnS量子点： La Mer等38首先提出无机物常规加热沉淀法制备CdS，后来，Brus和Rossetti等39,40进一步发展了该方法。如用CdSO4和(NH4)2S反应，通过改变合成条件，可以可控地合成不同粒径的CdS量子点39。正确地选择溶剂、pH、温度和钝化试剂，可降低量子点的溶解度；调节pH值可改变成核作用的动力学；严格分离快速成核作用和慢的生长过程，可提高样品的单分散性；使用介电常数较低的试剂或共聚物稳定剂，可提高胶体的稳定性。Rossetti等40在-77的低温条件下，利用静电双层膜的斥力作用停止附聚，得到了粒径约3nm的CdS立方晶体和小于2.0nm的ZnS立方晶体。尽管该方法合成CdS是非常有效的，但是一些重要的量子点，如CdSe等不易被合成，而且，由于产物一般为胶体状，在较高的温度下不是很稳定。“定域模板合成”是纳米材料合成中普遍采用的方法。该方法利用那些能够提供明显空腔的材料，如沸石、分子筛、胶束、聚合物等作合成模板，其空腔被用作纳米尺度的反应室，同时空腔大小起控制粒径作用41-45。Herron等41采用定域模板合成法，在沸石里进行从Na+到Cd2+的离子交换，然后，接触H2S气体，合成了CdS量子点。控制镉的用量，可以得到不同粒径的产物。利用层状Zr(O3PCH2CH2CO2H)2的层间空腔，也可以制备一系列ME(M=Cd，Zn，Pb；E=S，Se等)量子点43。以聚合物为模板的组装法是制备IIVI型量子点及其掺杂纳米材料（如CdS:Mn，ZnS:Mn，ZnS:Tb）的一种常用方法。聚合物可分为两类46：一类仅作为分散剂，不含有效的官能团，在合成过程中不与纳粒相互作用，如磺化聚苯乙烯（BSS）；另一类则含有效的官能团如巯基，一般将合成后的纳粒分散在这类聚合物中，利用纳粒表面与聚合物巯基的键连作用，使纳粒受到保护，如聚4-苯酚-4-羟基硫酚。这类聚合物只起到后期修饰作用而不能控制纳粒的尺寸。严纯华研究组46合成了聚苯乙烯-顺丁烯二酸酐（PSM），利用它在水溶液中可水解成二酸，从而具有配合能力的特性，作为CdS和ZnS等纳粒的制备模板。金属离子通过PSM的离子交换作用和螯合作用分散在其中，引入S2-离子，即可在原位形成嵌在聚合物中的硫化物半导体纳粒。同理可制备CdS:Mn，ZnS:Mn和ZnS:Tb等掺杂纳粒。与其他制备方法相比，聚合物的保护和限制作用可明显提高纳粒的稳定性。具体制备方法是： 合成PSM，将23.6g (0.24mol) 顺丁烯二酸酐、236mL甲苯在氮气保护下水浴加热溶解，用滴液漏斗滴入25g苯乙烯（0.24mol）、0.05g偶氮双异丁腈（AIBN）（0.1%）和100mL甲苯的混合溶液，在348K350K反应2h2.5h。得到聚合物PSM。过滤，滤饼用石油醚洗涤2次，用热水洗涤2次，在真空烘箱中313K干燥至恒重，得到42g PSM，产率86.4%。 制备PSM-CdS, PSM-ZnS及其掺杂纳粒。将1.0g新制的PSM和1.1g醋酸锌Zn(Ac)2加水混合，电磁搅拌72h。酸酐水解产生2个相邻羧基与Zn2+螯合配位，Zn2+均匀分布在聚合物中形成PSM-Zn。过滤，用水洗涤滤饼，干燥后以ICP确定所含Zn2+量。ICP结果表明，改变所用醋酸锌溶液的浓度和反应时间可得到不同Zn2+含量的PSM-Zn溶液。 称取计算量的PSM-Zn的固体，溶解于10.0mL二甲亚砜（DMSO）中，使25mL的反应体系中Zn2+的浓度为510-4mol/L，加入不同体积的水，待混合物冷却至室温，搅拌下慢慢滴入Na2S的水溶液，得到均匀嵌于PSM的ZnS纳粒（PSM-ZnS）。以Cd2+离子代替Zn2+离子，重复上述步骤可以得到CdS纳粒（PSM-CdS）。将Cd(Ac)2和MnCl2水溶液，以及Zn(Ac)2和MnCl2水溶液各按100:5摩尔比混合之后再分别以PSM浸泡、搅拌72h，可得到PSM-CdMn, PSM-ZnMn。经溶解、搅拌、加入一定浓度的Na2S水溶液后，得到均匀分散于PSM的CdS:Mn (PSM-CdS:Mn), ZnS:Mn (PSM-ZnS:Mn)纳粒，其制备条件与PSM-ZnS的相同。Wang等42用乙烯/甲基丙烯酸共聚物作模板，改变Pb2+的浓度，得到1.3nm12.5nm粒径范围的PbS。另一类可用作量子点合成的特殊而很有意义的模板是树状高聚物。Crooks等44用带羟基末端的不同大小的树状聚氨基胺（PAMAM）作模板合成了由模板包封的CdS量子点（DE-CdS）。合成过程中，模板既是纳米反应器又是产物的稳定剂，模板的大小影响量子点的大小，进而影响量子点的光谱性质，并且，模板表面大量的功能基团使产物几乎可溶于任何溶剂，还可以与生物配体、DNA等目标物直接结合。Murphy等45研究了用4.0代树状PAMAM为模板进行DE-CdS纳米团的合成，先在N2气氛10下配制1.1410-4mol/L的PAMAM甲醇溶液，将62mg Cd(NO3)2.4H2O、15mg NaS分别溶解于两份100mL甲醇，制得Cd2+，S2-的储备液，然后在10条件下，将0.5mL等份的Cd2+和S2-的储备液重复10次加入PAMAM的甲醇溶液中即可得到产物。这种纳米团表现出特有的恒定正偏振的蓝光发射，以及长达几个月的稳定性。虽然可以在各种各样的局限模板里合成一系列纳米粒子，但是合成以后，去掉模板或者将纳粒从模板中有效分离出来而不影响粒径、形状等性质则是一比较麻烦的问题。Zhu等47则采用微波辐射加热，通过CdCl2或Zn(Ac)2与巯基乙胺在水溶液中快速反应，得到CdS和ZnS量子点。微波辐射加热具有操作简单、快速的优点，但是非热效应、超热效应等一些还不甚为人们所了解的微波现象，影响产物的均匀性等性质。Steigerwald等48用反向胶束溶液作定域模板，用含Zn2+离子的微乳溶液与(TMS)2S反应，得到了ZnS纳米晶粒。利用单一的金属-E键（E=S，Se等）已经存在的前体作反应物可合成II-VI量子点。Trindade和OBrien49,50发现，在三正辛基膦(TOP)中热分解CdE2CNR1R22，特别是空气稳定的不对称基取代物可以有效地进行II-VI量子点的制备。例如，用Cd(S2CNEt2)2(Et为乙基)可以得到CdS量子点。使用单种前体作原料，操作安全、简便。但是，由于前体均需自己合成，所以要得到产物量子点，需要多步合成，程序比较麻烦。CdSe量子点： 基于B族金属无机化合物或金属有机化合物与A族元素有机物之间的反应可制备II-VI量子点。Steigerwald等51将Cd(CH3)2和(TMS)2Se（TMS为三甲基甲硅烷基）（Se也可以换成S和Te合成相应的CdS和CdTe）在不同溶剂中混合制备了CdSe。Murray等52将Cd(CH3)2和TOPSe混合到TOP中，然后快速注入到热的氧化三正辛基膦(TOPO)溶剂中，这种快速注入使得反应物的浓度突然达到过饱和，因而立即发生成核作用，得到纳米颗粒的CdSe，接着经过缓慢的成熟过程和退火处理，再进行粒径选择性沉降和分离即可得到表面被TOPO钝化的高质量的CdSe量子点，量子产率约为10%。通过改变合成温度，可以控制粒径（2.4nm23nm），表面的TOPO可以用吡啶、呋喃等代替。类似地，Hines等53还用Zn(CH3)2和TOPOSe为原料制备了ZnSe。尽管用这种裂解方法可以制备高质量、单分散（5%）的II-VI量子点，但是，由于Cd(CH3)2、Zn(CH3)2等金属有机物剧毒、不稳定、易爆炸，因此，用它们作原料极其危险，需要的设备条件苛刻。Peng等54用CdO代替Cd(CH3)2，采用己基膦酸(HPA)或十四烷基膦酸（TDPA）/TOPO二组分溶剂合成II-VI量子点。例如，他们将0.0514g CdO，0.2232g TDPA和3.7768g TOPO加入到25mL的反应器，然后在气流中加热到300320让CdO熔解，再将溶解于2g TOP的0.0664g Te丸溶液注入反应瓶，接着使溶液保持在250生长以得到所需粒径的产物CdTe。这种方法使得工业规模的合成成为可能。他们发现在热的TOPO中，Cd(CH3)2裂解会产生不溶的金属Cd沉淀，在强的配体，如HPA或TDPA存在且MCd/MHPA或MTDPA1时，Cd(CH3)2立即转变为Cd-HPA/TDPA复合物，再注入TBPSe（TBP为三丁基膦），可以生成高质量的CdSe纳米晶粒。由此，他们推测Cd(CH3)2并不是必须的反应物。实验结果表明，用CdO作镉的前体，可以重复性地单罐合成高质量II-VI系列纳米粒子，如CdSe、CdTe、CdS等。而且，由于Cd-HPA/TDPA复合物相对较高的稳定性，采用这种方法，最初的成核作用可以推迟到数百秒以后，这就使得该方法在实际操作中有几点重要的优点：注射温度可以降低，合成的重复性好；最初的成核作用可以延长，并且CdO既不自燃，也不易爆炸，因此，可以使用大量的反应原料，这就使得工业规模的合成成为可能54。此后，他们又发现Cd(Ac)2、CdCO3等镉的弱酸盐都可以用作CdSe合成的优良前体，而硬脂酸（SA）、十二烷酸（LA）等脂肪酸可以用作溶剂。综合起来，可以得到一系列用于CdSe合成的前体/溶剂组合，如Cd(Ac)2-SA/TOPO、Cd(Ac)2-SA、CdCO3-SA/TOPO、CdO-TDPA/TOPO、CdO-LA/TOPO、Cd(Ac)2-TechTOPO等，其中，Cd(Ac)2和硬脂酸分别是优良的前体和溶剂/配体。但是，用硬脂酸作溶剂时，产物的粒径较大，且范围较宽，而膦酸/TOPO、工业纯TOPO或分析纯 TOPO是进行有严格尺寸范围限制、尤其是小粒径合成的优良试剂55。例如，他们用Cd(Ac)2/工业纯TOPO合成了粒径大约为3.2nm的CdSe56。由于以上试剂相对安全得多，反应可以不在手套箱中进行，从而大大改进了II-VI量子点的制备条件，简化了实验操作。Trindade和OBrien49,50在TOP中热分解CdSe2CN(CH3)Hex2(Hex为己基)得到了优质的CdSe量子点。CdSe量子点还可以通过Cd(Seph)2(ph为苯基)或Cd(Seph)22Et2PCH2PEt2在4-乙基膦中裂解制得57。Steigerwald等58用反向胶束溶液作定域模板，用含Cd2+离子的微乳溶液与(TMS)2Se反应，得到了CdSe纳粒。Zhu等59在pH9-10范围内，将N(CH2COOK)3（NTA，160mmol/L）和CdSO4（80mmol/L）的水溶液与Na2SeSO3（80mmol/L）水溶液混合，立即将混合溶液置于微波回流系统中加热，反应10min，然后，将产物离心，丙酮反复洗涤，真空干燥，得到CdSe纳米粒子。改变微波反应时间，可以得到不同状态的产物。（2） 核/壳型量子点量子点荧光的产生，是由于其吸收激发光以后，产生电荷载体的重组，如果制备的量子点有大量的缺陷，就会发生电荷载体的无辐射重组，严重影响量子产率，如果缺陷位于粒子的表面，那么就有可能通过化学方法来影响这些缺陷。大量的研究表明，II-VI量子点的荧光性质确实可以通过其表面修饰，特别是在其表面包覆另一种晶体结构相似、带隙更宽的半导体材料，制得核/壳型纳米晶粒（如CdS/ZnS、CdSe/ZnS、CdS/ZnO等），使表面无辐射重组位置被钝化、减少激发缺陷而使量子点的荧光性质得到改善，量子产率明显提高。同时，这种核/壳结构还可增强核的稳定性和改善生物亲和力。例如，在CdSe表面覆盖适当厚度的ZnS制得CdSe/ZnS量子点，不但可以避免CdSe见光氧化（生成不稳定的硒氧化物），大大增强核的稳定性，而且产物有很好的单分散性，覆盖ZnS没有使CdSe发生大的变型，吸收和发射光谱位置和形状都没有发生明显的变化，而光致发光的量子产率从原来的5%15%提高到了30%50%60,61。由于核/壳型量子点具有优异的特性，所以有关其制备及性质的研究引起高度重视。严纯华研究组61采用水热法制备CdS纳粒及CdS/ZnO核/壳型纳粒。水热、溶剂热合成技术是指在特制的密闭反应器（高压釜）中，采用水或其它溶剂作为反应体系，加热至或接近于临界温度，在高压环境进行无机合成和材料制备的一种有效的方法，常用于纳米材料的制备62。其主要特点是，所制得的纳米颗粒物相较均匀