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微生物学大实验市售食品中腐败菌的分离纯化及其生物学性状的观察 姓名：刘晓雪班级：食品科学与工程2班指导教师：关桦楠同组人：陆婧婧、姜磊、贾玲、隋颖、李虹颖、张凯实验报告成绩：一、 前言食品腐败变质是指食品受到各种内外因素（例如温度，气体等）的影响，造成其原有物理性质或化学性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程。食品腐败变质的过程实质上是食品中碳水化合物、蛋白质、脂肪在污染微生物的作用下分界变化、产生有害物质的过程。 本次实验以鱼排为材料，它里面含有碳水化合物、蛋白质、无机酸、维生素、有机酸和大量的水分 PH 一般偏向酸性（4.57.0）这些条件都很适合微生物的生 长繁殖。这些微生物大部分是嗜酸性微生物即霉菌、酵母菌和某些细菌。我们运用营养琼脂培养基、麦芽汁培养基、马铃薯培养基、平板划线、点植、涂布等方法从中分离出腐败菌，观察和分析其菌种及菌落形态。食品中腐败菌的主要是大肠菌群，大肠菌群是人及动物肠道中的正常寄居菌，食物或水中大肠菌群的检出意味着直接或间接的近期粪便污染。大肠菌群作为饮水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标，而且在外界存活时间与一些肠道病原菌相似，它的出现可能意味着某种肠道病原菌如沙门氏菌、志贺氏菌的存在。大肠菌群是国际上公认的卫生监测指标，因此大肠菌群的检测技术十分重要。二、实验材料药品和仪器2.1 实验材料市售食品鱼排在1822，湿度为59%，放置3-4个星期 2.2 实验药品营养琼脂培养基、马铃薯培养基、麦芽汁培养基和乳糖胆盐培养基；葡萄糖糖发酵试剂盒、乳糖糖发酵试剂盒、麦芽糖糖发酵试剂盒和蔗糖糖发酵试剂盒；无菌水、番红、结晶紫、酒精、碘液、美蓝。2.3 仪器设备显微镜、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、冰箱、电磁炉等、烧杯、量筒、大试管、小试管、锥形瓶、培养皿、无菌移液管、酒精灯、接种环、天平、胶塞、胶头滴管、报纸、皮筋、标签等。三、实验方法3.1 食品中腐败菌的分离（1）将市售食品鱼排1-2 g（自行定量，饮料样品可直接使用）捣碎并置于100 mL无菌水中，充分震荡制成混悬样品液。（2）培养基的制备：营养琼脂培养基：称取4.5 g营养琼脂粉，加入100 mL水加热溶解，分装，在121下蒸汽灭菌。20 min后取出导入无菌平皿中冷却凝固。马铃薯培养基：将去皮土豆200 g切成2 cm左右小块加入1000 mL水煮沸10 min，过滤补充水份，加入20 g琼脂粉，20 g葡萄糖，加热溶化，分装，121下蒸汽灭菌20 min。麦芽汁培养基：称取5 g麦芽粉加入100 mL和2 g琼脂，在121下蒸汽灭菌20 min。（3）采用平板划线法分离细菌（营养琼脂培养基）：将混合菌分离样品摇匀，接种环火焰灭菌后，在火焰边取出试管塞，火焰灭菌后至少凉4秒，再将接种环插入样品试管中，取出样品，并将试管塞塞紧，左手掀开皿盖，右手持接种环，自皿的一边开始轻轻的来回划线。（4）采用涂布法分离酵母菌（麦芽汁培养基）：取少量样品液（不超过0.1 mL）滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810 s，用涂布器将样品液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。（5）采用点植法分离霉菌（马铃薯培养基）：接菌环轻微接触食品腐烂处，然后点植在培养基表面，一般点6个点。（6）把不同类型的培养基放入到培养箱中，28-30倒置培养。3.2腐败菌的生物学性状初步鉴定（1）腐败菌中细菌的观察鉴定（革兰氏染色法）：在载玻片中间滴一滴生理盐水，点燃酒精灯，接种环在酒精灯附近灭菌，后在营养琼脂培养基上取样，均匀涂片。固定时通过火焰1-2次，不可过热，以载玻片不烫手为宜。滴加初染液草酸铵结晶紫1滴，约1 min后，水洗。加碘液媒染1 min，并覆盖约一分钟，水洗。95%酒精脱色处理，观察流出液的颜色，衬以白色背景，无色时，脱色终止，马上水洗并吸干。加番红复染1-2 min，水洗。镜检 油镜观察，革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色，以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。（2）腐败菌中酵母菌的观察鉴定在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液，按无菌操作法在营养琼脂培养基上取培养48小时的菌种少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。用镊子夹盖玻片一块，小心的盖在液滴上，该片时应注意，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免长生气泡。将制好的水浸片，放置3 min后镜检。（3）腐败菌中霉菌的观察鉴定在载玻片中央滴加一滴乳酸酚用针挑取菌落周边放在乳酸酚中搅拌匀,盖上薄片，至于显微镜观察.在载玻片中央加一染色液或水于洁净载玻片上，打开霉菌平板培养物，用接种针从菌落的边缘挑取少量带有孢子的菌丝，放入载玻片的染液中，细心地把菌丝挑散开，加盖玻片，注意不要产生气泡，置于显微镜下观察。3.3 细菌的生理生化鉴定分别将不同种类的菌落分别接种于葡萄糖糖发酵管、乳糖糖发酵管、麦芽糖糖发酵管和蔗糖糖发酵管中，放入培养箱中培养，观察是否产酸产气，结合生物学观察结果初步判定腐败菌中细菌的种属。3.4腐败菌中细菌菌落总数的测定（1）在酒精灯旁将腐败的食品样品2.5g剪碎（剪刀需用酒精灯灭菌）放于含有225 mL灭菌水的广口瓶内或锥形瓶内，经充分振摇或研磨用成1:100的均匀稀释液（此时稀释浓度为10-2）。（2）用1.0 mL灭菌吸管吸取1:100稀释液1.0 mL，沿管壁徐徐注入含有9.0 mL灭菌水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内液面），振摇试管混合均匀，作成1:1000的稀释液（此时稀释浓度为10-3）。（3）用1.0 mL灭菌吸管吸取1:1000稀释液1.0 mL，沿管壁徐徐注入含有9.0 mL灭菌水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内液面），振摇试管混合均匀，作成1:10000的稀释液(此时稀释浓度为10-4)。（4）用1.0 mL灭菌吸管吸取1:10000稀释液1.0 mL，沿管壁徐徐注入含有9.0 mL灭菌水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内液面），振摇试管混合均匀，作成1:100000的稀释液（此时稀释浓度为10-5）。（5）将三种浓度的稀释液（10-3、10-4和10-5）取1 mL移入平皿后，应及时将凉至40-50营养琼脂培养基注入平皿15-20 mL，并转动平皿使与稀释液混合均匀。每种稀释度做两个平皿，每组共计6个平皿。（6）待稀释液入平皿后，倒置平板，置36温箱内培养242 h取出，计算平板内菌落数，乘以稀释倍数，即得每g（或mL）样品所含菌落总数。3.5 腐败菌中大肠菌群的鉴定（1）在酒精灯旁将腐败的食品样品2.5 g剪碎（剪刀需用酒精灯灭菌）放于含有225 mL灭菌水的广口瓶内或锥形瓶内，经充分振摇或研磨用成1:100的均匀稀释液（此时稀释浓度为10-2）。（2）用1.0 mL灭菌吸管吸取1:100稀释液1.0 mL，沿管壁徐徐注入含有9.0 mL灭菌水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内液面），振摇试管混合均匀，作成1:1000的稀释液（此时稀释浓度为10-3）。（3）用1.0 mL灭菌吸管吸取1:1000稀释液1.0 mL，沿管壁徐徐注入含有9.0 mL灭菌水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内液面），振摇试管混合均匀，作成1:10000的稀释液(此时稀释浓度为10-4)。（4）将10-2稀释液10 mL接种于双料乳糖胆盐发酵管内（即为0.1 g或mL），将10-3和10-4的稀释液各1 mL分别接种于单料乳糖发酵管内（分别为0.01和0.001 g/ml），每个稀释度3个平行，全组共9管37温箱内培养482h取出，倒置培养。（5）观察产酸产气现象。小倒管中是否有气泡，如有气泡，则记为大肠阳性管（+）；如无气泡，则记为大肠阴性管（-）。（6）计算每100 mL（g）样品中大肠菌群最可能数（MPN）。（7）挑选产酸产气的菌落进行革兰氏染色观察，初步判别是否是大肠菌群。4 结果与分析4.1 腐败菌中不同类型微生物的菌落特征（1） 营养琼脂培养基中细菌的菌落特征 细菌的菌落特征表1 细菌菌落特征表菌落特征菌落1菌落2菌落大小中表面形状圆形边缘整齐颜色乳白色厚度隆起透明度半透明整体致密度致密（2）麦芽汁培养基中酵母菌的菌落特征 图2 酵母菌的菌落特征表2 酵母菌菌落特征表菌落特征菌落1菌落2菌落大小小表面形状圆形边缘整齐颜色乳白色厚度扁平透明度半透明整体致密度致密（3）马铃薯培养基中霉菌的菌落特征图3 霉菌的菌落特征 表3霉菌菌落特征表菌落特征菌落1菌落2菌落大小大大表面形状不规则不规则边缘不整齐不整齐颜色灰色黑色厚度隆起隆起透明度不透明不透明整体致密度致密致密4.2腐败菌中不同类型微生物的菌体形态观察鉴定（1）腐败菌中不同种类细菌的菌体形态观察鉴定 图4 腐败菌中细菌的菌体形态观察 初步判断为大肠杆菌，和球菌（2）腐败菌中不同种类霉菌的菌体形态观察鉴定 图5 腐败菌中霉菌的菌体形态观 初步判断黑霉和毛霉4.3腐败菌中细菌的糖发酵实验（1）产酸产气结果图7 四种糖发酵管产酸产气示意图（2）糖发酵管试验结果编 号 葡萄糖 乳糖 蔗糖 麦芽糖试管1 + + - + 注：“+”表示产酸，“-”表示不产酸，“”表示产酸产气。菌种初步判断：由革兰氏染色及产酸产气结果初步判断此菌为大肠杆菌。4.4腐败食品中细菌菌落总数的测定（1）不同稀释度培养基中菌落特征 图8 不同稀释平板菌落形态菌落描述：菌落小，表面呈圆形，边缘整齐，颜色呈乳白色，厚度扁平，不透明，湿润.(2)菌落总数的测定10-310-410-5菌落总数113049204004.610729201032520稀释度菌落数皿号4.5腐败食品中大肠菌群的测定（1）乳糖胆盐产酸产气实验图9 乳糖胆盐产酸产气图（2）大肠菌群MPN值的测定菌落阳性管数MPN值0.10.010.001菌落10013.0菌落2（3）产气样品的菌体形态观察 图1 图2 图10产酸产气菌落的革兰氏染色图片论述分析：1)经革兰氏染色观察到图2菌落呈红色，为革兰氏阴性菌，形状为杆形，判断为大肠杆菌。 2)经革兰氏染色观察到图1菌落呈红色，为革兰氏阴性菌，形状为球形。5 结论与讨论1.经分析鉴定得出腐败菌的菌种为大肠杆菌，球菌，黑霉，毛霉，酵母菌2.防止此类食品的腐败：1）.降低含水量.日晒法，阴干,喷雾干燥，热风干燥，接触干燥，减压蒸发，辐射干燥，真空冷冻干燥。2）.提高食品的渗透压.例如：盐腌，8%-10%；糖渍，60%-65%。3）.降低食品的储存温度.冷藏；几天到几周。嗜冷菌生长，蔬菜水果采后呼吸。冷冻；控制腐败变质有效，但对食品理化性质影响较大。4）.使用抑制微生物的化学物质.防腐剂，熏制，酸防腐。5）.生物防腐.发酵，降低pH,抑制微生物生长。3. 实验心得和体会：在本次试验中我学会了点植法、涂步发，平板划线法等方法，学会了使用乳糖胆盐培养基。在做测试技术的实验前,我以为不会难做,就像以前的实验一样,做完实验,然后两下子就将实验报告做完.直到做完测试实验时,我才知道其实并不容易做,但学到的知识与难度成正比,使我受益匪浅.在做实验前,一定要将课本上的知识吃透,因为这是做实验的基础,否则,在老师讲解时就会听不懂,这将使你在做实验时的难度加大,浪费做实验的宝贵时间.如果你不清楚,在做实验时才去摸索,这将使你极大地浪费时间,使你事倍功半.做实验时,一定要亲力亲为,务必要将每个步骤,每个细节弄清楚,弄明白,实验后,还要复习,思考,这样,你的印象才深刻,记得才牢固,否则,过后不久你就会忘得一干二净,这还不如不做.做实验时,老师还会根据自己的亲身体会,将一些课本上没有的知识教给我们,拓宽我们的眼界,使我们认识到这门课程在生活中的应用是那么的广泛. 通过这次测试技术的实验,使我学到了不少实用的知识,更重要的是,做实验的过程,思考问题的方法,这与做其他的实验是通用的,真正使我们受益匪浅.6 参考文献1武汉大学，复旦大学生物系微生物教研室编微生物学北京：高等教育出版社，19802李季伦，张伟心，杨启瑞等微生物生理学北京：北京农业大学出版社，19933黄秀梨微生物学（第2版）北京：高等教育出版社，20034俞大绂，李季伦微生物学（第2版）北京：科学出版社，19855. 彭珍荣现代微生物学武汉：武汉大学出版社，1995
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