化学农药环境安全评价试验准则.doc

化学农药环境安全评价试验准则1农药对环境安全性影响的因素化学农药对环境的安全性与农药的性质、施用方法及施用地区的气候土壤条件密切相关，就这三方面的问题分别讨论如下：1.1农药的理化性质对生态环境安全性影响的预测农药理化性质的指标很多，它们从不同方面影响农药对环境的安全性，其中影响最大的有以下几个指标：1.1.1蒸气压农药进入环境后在气、水、土各介质间迁移、扩散与再分配特性受农药蒸气压影响很大，蒸气压愈大，农药就愈容易从土壤或水域环境转向大气空间，这样就容易进一步引起农药的光降解作用；农药在土壤中的移动性能，受农药蒸气压影响也很大。1.1.2水溶性水溶性的大小对农药在环境中的移动性、吸附性、生物富集性以及农药的毒性都有很大影响。水溶性大的农药容易从农田流向水体，或通过渗漏进入地下水之中，也容易被生物吸收，导致对生物的急性危害；水溶性弱脂溶性强的农药，容易在生物体内积累，引起对生物的慢性危害。1.1.3分配系数分配系数是指农药在互不相溶的两种极性与非极性溶剂中的分配能力，分配系数大的农药容易在非生物物质与生物体内富集，分配系数小的农药，容易在环境中扩散，从而也扩大了农药的污染范围。1.1.4化学稳定性农药的稳定性是指农药进入环境后遭受物理、化学因子影响时分解难易程度的指标，这是评价农药在环境中稳定性基础资料。1.1.5杂质一般优质农药其杂质成份对农药影响不大，但有些农药的杂质成份则成了影响环境安全的主要对象，如666中的几点种异构体，氟乐灵中的亚硝烟弥漫胺，甲胺磷中的不纯物等，因此农药的纯度和不纯物的成份必须在基础资料中提供。1.2农药环境行为特征对环境安全性影响预测农药环境行为是指农药进入环境后，在环境中迁移转化过程中的表现，其中包括物理行为、化学行为与生物效应等三个方面，它比农药理化特性指标更直观地反映了农药对生态环境污染影响的状态。农药环境行为的主要指标有：1.2.1挥发作用农药挥发作用是指在自然条件下农药从植物表面、水面与土壤表面通过挥发逸入大气中的现象。农药挥发作用的大小除与农药蒸气压有关外，还与施药地区的土壤和气候条件有关。农药残留在高温、湿润、沙质的土壤中比残留在寒冷、干燥、粘质的土壤中容易发挥。农药挥发性的大小，也会影响农药在土壤中的持留性及其在环境中在分配的情况。挥发性大的农药一般持留较短，而在环境中的影响范围较大。1.2.2土壤吸附作用农药吸附作用是指农药被吸持在土壤中的能力。农药吸附能力的强弱决定与农药的水容性，分配系数与离解特性等。水溶性小，分配系数大，离解作用强的农药，容易被土壤吸附；土壤性质对农药吸附作用的影响也很大。有机质含量高，代换量大，质地粘重的土壤，就容易吸附农药。农药吸附性能的强弱对农药的生物活性、残留性与移动性都有很大影响。农药被土壤强烈吸附后其生物活性与微生物对它的降解性能都会减弱。吸附性能强的农药，其移动与扩散的能力弱，不易进一步造成对周围环境污染。1.2.3农药淋溶作用农药淋溶作用是指农药在土壤中随水垂直向下移动的能力。影响农药淋溶作用的因子与影响农药吸附作用的因子基本相同，恰好成反相关关系。一般来说，农药吸附作用愈强，其淋溶作用愈弱。另外与施用地区的气候、土壤条件也关系密切。在多雨，土壤砂性的地区，农药容易被淋溶。农药淋溶作用的强弱，是评价农药是否对地下水有污染危险的重要指标。1.2.4土壤降解作用农药在土壤的降解包括土壤微生物降解、化学降解与光降解三部分。影响土壤降解的因子，除与农药的性质有关外，与气候及土壤条件密切。在高温湿润，土壤有机质含量高，土壤微生物活跃和土壤偏碱的地区，农药就容易降解。土壤是农药在环境中的贮藏库，也是农药在环境中的集散地。农药在土壤中的降解性能，是评价农药对整个环境危害影响十分重要的指标。农药在土壤中的持留愈长，对环境的污染以及对各种环境生物，以至对人类的潜在威胁也愈大。1.2.5水环境中的降解与水解作用农药在水环境中的降解是指农药在水环境中遭受微生物降解、化学降解与光降解的总称，它是评价农药在水体中残留特性的指标。其降解速率受农药的性质与水环境条件两方面因子所制约。水解是指在实验室特定条件下农药遭受化学降解的能力。一般的农药，在高温、偏碱性的水体中容易降解。1.2.6农药光降解是指挥发进入大气中的农药与残留在作物、水体和土壤表面的农药在阳光的作用下遭受光降解的能力。农药光降解作用的难易除与农药的性质、施药季节的光照强度有关外，还与农药在环境中的存在状态，以及环境中是否存在有光敏性质有关。溶液中含有丙酮或环境存在有胡敏酸、富非酸等物质时，对一般农药都能促进其光降解强度。1.2.7生物富集作用生物富集作用是指农药从环境中进入生物体内蓄积，进而在食物链中互相传递与富集的能力。农药生物富集作用大小与农药的水溶性、分配系数以及与生物的种类，生物体内的脂肪含量，生物对农药代谢能力等因子有关。农药的生物富集能力愈强，对生物的污染与慢性危害愈大。1.3农药施用方法对环境安全影响预测农药的不同施用方式对农药在环境中的行为与对非靶生物安全性影响关系极大，主要影响因子有；1.3.1剂型不同的农药剂型对农药在环境中的残留性、移动性以及对非靶生物的危害性均有影响。从农药在环境中残留性比较，颗粒剂粉剂乳剂；对非靶生物接触危害的程度比较，它刚好与残留性成反相关关系。1.3.2施药方法喷施、撒施，特别是用飞机喷洒的方式，影响范围广，对非靶生物的危害性大；条施，穴施和用作土壤处理的方法，污染范围小，对非靶生物比较安全。1.3.3施药时间施药时间的影响主要与气候条件及非靶生物生长发育的时期有关。在高温多雨地区，农药容易在环境中降解与消散，在非靶生物活动期与繁殖期喷洒农药，对非靶生物的杀伤率大；另外，施药时间对农产品是否会遭受污染的关系也十分密切。1.3.4施药数量农药对环境的危害性主要决定于农药的毒性与用量两个因子。高毒的农药，只要将其用量控制在允许值范围内，它就不会造成对环境的实际危害；相反，低毒农药用量过大，同样会造成危害。1.3.5施药地区与施药范围施药地区的影响主要与当地的气候与土壤条件有关，在高温多雨地区，农药在环境中消减速率就要比在干寒地区快；在稻田或碱性土中施用农药，一般比在旱地或酸性土中降解要袂；施药范围愈广，其影响面也愈大。在水源保区、风景旅游区与珍稀物种保护区施用农药，更应注意安全。1.4农药对非靶生物影响的预测在靶生物与非靶生物并存的环境中，使用农药难免对非靶生物会造成一定的危害。不同的农药品种，由于其施药对象、施药方式、毒性及其危及生物种类的不同，其影响程度也随之而异。环境生物种类很多，在评价时只能选择有代表性的，并具有一定经济价值的生物品种，其中包括陆生生物、水生生物和土壤生物作为评价指标。2农药安全性评价指标与评价试验程序2.1农药环境安全评价指标由于农药的环境安全性评价还兼有安全性综合评价的职能，因此，在进行环境安全评价时，除了提供环境评价必备的资料外，还须提供有关的基础资料与附加试验资料，所谓必备的评价资料，是指由国家环境保护局规定的项目，它是评价环境安全性的核心资料；而基础资料可参照或引自化工部门、卫生部门或农业部门提供的实验数据；附加资料是指在审查必备资料时认为还须补充提供的一些试验项目。这三部分资料的具体内容如下：2.1.1必备资料A基本理化性质与环境行为特征指标水溶性、蒸气压、分配系数；挥发作用、土壤吸附作用、淋溶作用、土壤降解作用、水解作风、光降解作用、富集作用。B非靶生物的毒性指标鸟类、蜜蜂、家蚕、天敌（赤眼蜂、蛙类）、鱼类、水蚤、藻类、蚯蚓、土壤微生物。2.1.2基础资料A农药理化特性指标农药的通用名、化学名、结构式、有效成份合量及杂质成份、熔点、沸点、密度、外观、吸收光谱-紫外、可见光谱，乳化性、悬浮性、储藏稳定性。B推荐的农药使用模式与作物残留资料剂型、施用方法、施用时间、施用数量、施用地区和施用范围以及农药在作物上的最终残留量和MRL值。C农药的毒理学指标农药对温血动物的急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性与三致试验资料及ADI值。2.1.3附加资料对一些溶解度大，吸附性弱，同时又有可能污染化水体的农药，必要时须做地下水影响评价试验；在土壤中积累性强，对环境可能有危害的降解产物，须增做有毒降解物的环境行为与生物效应试验；对一些脂溶性强，毒性大，在生物体内难降解的农药，及其具有同样性质的代谢产物，须进一步做富集性试验与慢性毒性试验。2.2农药环境安全评价试验程序由于农药的品种很多，性质和使用方法各异，因此在安全评价时要求提供的指标也随之而异。对拟开发的农药品种，首先要测定其对环境行为密切相关的几个理化指标，包括水溶性、蒸气压、分配系数，然后同时进行对非靶生物的急性毒性试验与农药的环境行为特征试验。在非靶生物的毒性试验中，在旱地上喷施、撒施的农药，须做陆生生物的毒性试验，包括对鸟类、蜜蜂、家蚕、天敌、蚯蚓与土壤微生物的影响；用作土壤处理的农药，仅须做对蚯蚓土壤生物的影响；种子包衣或用作毒饵的农药，只须做对鸟类的毒性；而对虽用与旱地，但其残留性与移动性都很强，有污染水体危害的农药，须做对水生物毒性试验。用于水田或直接用于水域的农药，须做对水生生物的毒性试验，包括鱼类、水蚤和藻类；对一些挥发性、飘移性强，用于水田的农药，应增加做对陆生生物的毒性试验。环境行为试验部分，分在水域施用与在农田施用（包括旱地和水田）两种不同情况：直接用于水域的农药，须做在水体中的降解性试验，对其中难降解的农药，还须做在鱼体内的富集试验与慢性毒性试验；用于农田的农药，首先要做土壤降解试验，对其中难降解的农药，既要求做对蚯蚓、鸟类的富集试验和慢性试验，又要求做在土壤中的移动性能的测定；对其中移动性强，又有可能污染水体的农药，还要进一步做农药在水体中的降解试验与在鱼体内的富集试验和慢性毒性试验，必要时还要做对地下水影响评价试验。对一些蒸气压高的农药，须做辉发性试验。上述评价试验程序适用于杀虫剂、杀菌剂、除草剂与植物生长调节剂在农田或水域中施用时的情况，对卫生用药与杀鼠剂的评价试验须另作规定。对一些可能进入环境的其它有毒化学品的评价试验，也可参照本试验程序试行。以上是新农药在申请登记时须要做的农药环境安全性预评价工作。对一些使用量大，在预评价中对其潜在危害性一时尚难确定的农药品种，在其登记后，仍须在实地做一些化学与生物的监测与监视的安全性现状中发现有较大问题的农药品种，在其申请农药再登记时，就可修改其原登记的有关条款。3农药对环境安全性评价试验准则3.1环境行为特征评价试验准则（包括理化特性部分）3.1.1蒸气压测定测定蒸气压的方法很多，有动态法、静态法、蒸气压力计法，蒸气压平衡法、气体饱和法等，各种不同方法适用于一定蒸气压范围的化合物，一般农药的蒸气压较低，气体饱和适用多数农药的蒸气压测定。3.1.2溶解度测定供试农药要用纯品，试验用水用重蒸馏水，温度一般为20，或根据使用地区情况选择两极温度，因各种农药的溶解度差异很大，分别选用以下合适的测定方法，溶解度的单位用g/L或mg/L。（1）柱淋洗法适用于溶解度10-2g/L的物质，将供试农药在略高于试验温度的水中溶解，然后将温度降至试验温度，并在20的恒温下振摇24小时，达到平衡后，除去不溶物，再测定溶液中农药的浓度，即为水中的溶解度。农药水溶性的大小，可用来估算农药的分配系数与生物富集性；农药的安全性，根据水溶性的大小可划分为三类：a溶解度500ppm的农药，不易在生物体内富集，但易引起急性危害。3.1.3分配系数测定农药的分配系数ow通常是指一定温度下,农药在等体积正辛醇与水两个不互溶解的液相系统中分子浓度的分配比，常以ogKow值表示.。测定分配系数的方法是：将农药加入正辛醇与水的两相溶液体系中，充分摇匀，对一般农药只需震荡1小时，溶解度0.01ppm的农药需振荡24小时达到平衡后，分别测定两相中农药的含量，每种农药要做两种不同浓度，通常是用C16的农药，也难以用此方法作出准确测定。另一种简便的方法在水中溶解度，应用同类农药已知的分配系数与水溶性之间的相关公式估测农药的分配系数。3.1.4挥发作用试验凡进入到土壤或水域中的农药都要进行挥发作用的评价。凡属易挥发的农药，需进一步到位做好农药及其代谢物的试验室挥发作用测定或田间测定。测定挥发作用的方法是在气流式密闭模拟装置中进行。在田间测定挥发作用时，可用农药的制剂与按推荐的农药用量，并要记录试验地区的土壤及气候条件。3.1.5土壤吸附作用试验供试农药须用纯品或标记农药，试验浓度最好不超过农药最大溶解度；对难溶于水的农药，可用少量有机溶剂助溶（乙腈），用量不得超过0.2%（V/V）。测定土壤对农药的吸附等温线时，至少要用三种性质差异较大的代表性的土壤和四种不同的农药浓度，并要求提供土壤pH值、有机质含量、代换量、土壤质地等资料。3.1.6土壤淋溶作用试验在农业上使用的农药，都要提供淋溶特性资料。淋溶作用与吸附作用密切相关，可利用吸附常数估计农药在土壤中的移动性。淋溶试验可用土壤柱淋溶法或土壤薄层层析法测定。用土壤柱淋溶法测定时，对易降解的农药，最好同时测定降解作用。试验时可模拟农药使用地区的气温与降雨条件，并提供土壤PH、有机质、代换量、土壤地等资料。目前常用的是土壤薄层层析法，试验时最好用标记农药或农药纯品，至少要用四种不同性质的土壤，常用的砂土、砂壤、粉砂壤、粘壤，土壤有机质含量在1-5%，pH4-8之间，最好是取主要地区的土壤做试验。测定方法与一般的薄层层层落实析法相似，主要不同之点是用土壤作载体，用水作流动相。根据土壤层层析法得到的Rf值的大小，将农药划分为五个等级：极易移动0.90-1.00，可移动0.65-0.89，中等移动0.35-0.64，不易移动0.10-0.34，不移动0.00-0.09。测定农药淋溶的方法还有渗漏计法和田间渗漏测定法等。3.1.7土壤降解作用试验土壤降解试验先在室内进行（不包括光降解），如测定结果是残留性较长的农药，须进一步做田间降解试验与光降解试验；供试农药可用纯品或工业用品。难溶于水的农药，可用少量乙醇、丙酮等对农药降解过程无干扰的有机溶剂助溶。农药的用量最好用田间的实际用量来换算，或将土壤中农药的起始浓度调至10ppm。测定农药降解速率至少要用两种有代表性的新采集的耕层土壤。测定降解产物只需一种土壤，并要提供土壤pH值、有机质含量、代换量、土壤质地资料。试验一般在好气条件下进行，在三角瓶中将土壤水份调节到田间持水量的60%，塞上棉塞，在251恒温条件下培养，定期采样测定，直至土壤中农药的降解量达到两个半衰期以上，即降解量75%时可终止试验；用于水田的农药，则同时要做在渍水条件下的降解试验，在试验期一般取样5-7次测定农药残留量的变化，试验结果用指数回归议程求解半衰期。建议将有机化学农药的残留性，按照T1/2值的大小划分为三个等级：12个月的为长残留农药。3.1.8水环境中的降解作用试验对直接施用于水域或可能导致对水域产生影响的农药都要进行水环境中降解速率与降解产物的测定。先在实验室进行，如试验结果预计农药有较长的残留性，须进一步做野外试验；农药在水体中的降解包括生物降解、水解与光降解，分别讨论如下：（1）生物降解在水与底泥混合体系中测定水中农药降解试验的结果，实际上包括生物降解、水解与底泥吸附三部分综合作用的结果。试验样品应采自施药区或受农药污染的地区，采回的水与底泥在室内混合，底泥应保存在嫌气条件下，试验前预培养几天，并要测定底泥的pH值、有机质、代换量、土壤质地、Eh以及水体中的pH等。供试农药可用纯品或工业品，须测定代谢产物的最好用标记农药。农药的加入量不得超过农药的溶解度，一般可用10ppm，试验在251条件下进行，定期取水样测定至农药降解量到两个半衰期以上时止。试验结果用计算土壤降解时的指数顺归议程式求出农药在水中降解半衰期。如需测定挥发性的代谢产物，试验须在气流式的密闭体系内进行，这样可回收到挥发出来的降解产物。（2）水解供试农药要用纯品或标记农药，试验在灭菌避光的缓冲液中进行。农药的浓度最好在农药的水溶性范围内一一般可用10ppm，对溶解度极低的农药，可加入少量乙醇、甲醇、乙腈等有机溶剂助溶。溶液的pH通常用5、7、9三级；试验容器要灭菌、封口，在70的条件下培养48小时后测定。如试验结果水降解量少于生物降解量的10%，则可认为该农药具有化学稳定性，无须进一步试验；若水降解量大于生物降解量的10%，则须进一步做在25与50温度条件下的定期取样测定试验，到降解量大于两个半衰期为止。农药水解半衰期的计算方法与生物降解同。3.1.9光降解作用试验试验农药要用纯品或用标记农药，农药浓度最好在农药溶解度范围内，用蒸镏水配制；难溶于水的农药，可加入少量乙腈助溶，但不能用有光敏性的有机溶剂；试验用水的pH为5-8之间，最好接近中性；对于有离子化或质子化的化合物，最好用两级pH溶液作试验；试验容器、溶液均须灭菌，并封口，以防止生物降解与挥发。光源用人工光源，模拟太阳光，特别是紫外光部分，一般取280-400nm波段的波长；将处理好的溶液置于人工光源下照射，试验容器的受光面一定要用透紫外光的石英玻璃制成。试验过程中定期取水样测定农药浓度的变化，待降解量大于75%时止。试验须设黑暗条件下的空白对照，光降解半衰期的计算与水解试验同。3.1.10生物富集作用试验（BCF）测定生物富集系数的方法有静态法与动态法两种。对一般农药，通常先采用静态法试验。该法适用于BCF103的化合物。对高富集性的农药，此法只能反应具有高富集性的状况，但不易得到准确的数值；静态法对易降解与强挥发的农药不适用，对于这一类化合物须用动态法测定。用静态法测定BCF时，国外常用的鱼种有迥鱼、鲤鱼、虹鳟、鲢鱼等，在我国建议用鲤鱼作试验。试验鱼要健康，大小均匀，体重0.5g/尾，试验前先要经驯化饲养，经检验体内无待测物的残留，并要事先求出供试鱼种的TLm96值。试验时农药的浓度要小于TLm96值的1/100（或用不影响鱼类正常生长的最大允许值）。试验用两种浓度，各重复一次，并设不养鱼与养鱼不加农药的两种空白对照。前者通过测定来校正试验鱼缸中因挥发与降解所造成的农药浓度的变化，后者用作在试验结束时检查试验组鱼体重量有无异常变化与测定鱼体内的脂肪含量。试验农药用纯品，难溶于水的可用少量低毒、不易降解的有机溶剂（如叔丁醇或二甲亚砜）助溶，加量50mg/kg时，可免做对鸟类的口服急性毒性试验；如果供试农药在田间施用时，与鸟类有一定的接触时间，而且已有材料证明该农药在哺乳动物体内有一定富集作用者，除了要做口服急性毒性LD50外，还要做5天的药饲试验求LC50，少数残留期长，对鸟类有长期性暴露影响的农药，还须进一步做繁殖影响试验，观察鸟类对取食性能、繁殖行为、蛋壳、孵化率以及成活率等影响；对一些用实验室研究还难以明确其危害性的农药，须进一步做笼养试验，甚至是野外试验。供试鹌鹑用同一批大小均匀的鹑蛋孵化，饲养约30天，体重基本一致健康、活泼、雌雄各半的鹌鹑作试验用。供试农药用制剂或纯品，溶于水或植物油中，供口服急性毒性试验。一次服药后，连续七天观察死亡率；在正式试验前先做预试；然后在最高安全浓度与最低全致死浓度范围内按一定的浓度极差，设5-7个处理，进行正式试验，并设空白对照。试验在202与正常饲养条件下进行，试验结果用概率统计法求出LD50或LC50及95%的可信限。根据毒性测定结果，建议将农药对鸟类的急性毒性划分为三个等级：LD50150mg/kg为低毒级，15-150mg/kg为中毒级，11.0ug/峰。凡试验结果LD500.1ml/L。试验材料取自田间自然繁殖的蝌蚪，采回后先预养一天，再选健壮、个体均一的蝌蚪供试验用；试验容器为直径18cm、高9cm的玻璃缸，加入1000ml试液，每个处理投放10头蝌蚪，重复三次。正式试验前先用预试。然后在最高安全浓度与最低全致死浓度范围之间按等比级差设5-7个处理，并设空白对照，试验在自然气温条件下进行。试验开始后24小时、48小时观察记录蝌蚪的死亡率，用概率统计法求出LC50值与95%的可信限值。农药对蛙类的毒性分级标准，可参照鱼类的毒性分级标准。3.2.6蚯蚓毒性试验国外做农药毒性试验的蚯蚓品种，多数用日本的赤子爱胜蚯蚓（Eiseniafoelide），该品种在我国已普遍养殖，是目前理想的试验品种。农药对蚯蚓的致害途径，主要是土壤中的残留农药与蝗蚓的接触或被蚯蚓吞食所致。供试土壤种类的不同，导致至蚯蚓毒性的程度也有差别。为了使试验结果具有可比性，采用人工配制的标准土壤作为试验材料，将农药按一定的级差，配成5-7个等级，分别均匀地加入1公斤土壤中，调节到一定的湿度后，装于2升的培养缸中。每个处理养入个体大小相近的健壮蚯蚓10条，在202和有适量光照条件下进行试验。供试农药用制剂或纯品，对难溶于水的农药，可用丙酮助溶。拌入土壤后先将丙酮挥发掉后再做试验。蚯蚓的毒性试验需连续进行14天，于第7与14天时测定蚯蚓的死亡率，用概率法求半致死浓度LC50与95%的可信限值。上述方法得到的试验结果，建议按照LC50值的大小将农药对蚯蚓的毒性划分为三个等级：10ppm的为低毒农药。3.2.7土壤微生物毒性试验本试验用测定土壤微生物呼吸强度的方法，评价施用农药后对土壤微生物总活性影响的指标。供试土壤要用两种有代表性的新鲜土壤，并要提供pH值、有机质、代换量、土壤质地等数据。供试农药最好用制剂，也可用原药或纯品。每种土壤设1ppm、10ppm、100ppm三组不同浓度处理，并设空白对照，每组重复三次。难溶于水的农药，可用丙酮助溶。将药液先与少量土混匀，待丙酮发净后，再均匀拌入到处理的土壤中。每个处理用土50克，将土壤含水量调节成田间持水量的60%，装于100ml小烧杯中，与另一个装有标准碱液的小烧杯一起置于2升容积的密闭瓶中，于251的恒温箱中培养。试验开始后的第5、10、15天时更换出密闭瓶中的碱液测定吸收的CO2含量。当打开密闭瓶更换碱液时，同时更换了密闭瓶中的空气，以保证密闭瓶中的氧压维持在一定水平。用土壤中CO2释放量的变化，反映土壤微生物受农药抑制的程度，并以此为依据，建议将农药对土壤微生物的毒性划分成以下三个等级：用1ppm处理土壤，在15天内抑制值50%的为高毒农药；用10ppm处理的土壤，抑制值50%的为中毒的农药；抑制值50%的为低毒农药。3.2.8鱼类毒性试验国际上常用试验鱼种有斑马鱼、鲤鱼、夏裨鱼、黑头软口鲦、翻车鱼、底鳉、虹鳟；鲤鱼是我国主要鱼种之一，各地都有养殖材料易得，是理想的试验鱼种。试验鱼应用同时孵化，体长约2-3cm，健康无病的鱼苗先在室内驯化饲养7-14天，待鱼苗死亡率稳定在10%时开始试验。试验期间对照组的死亡率也应控制在10%以下。鱼的急性毒性测定方法，有静态法、半静态法和流动式法三种，在我国目前条件下，一般采用半静态法为宜（易水解与易挥发的农药不宜使用）。试验容器的大小，一般应控制在1克/升鱼水的范围内。试验期间定期更换药液，以保证水中药液浓度不低于加入量的80%，水中溶解氧不得低于饱和点的60%，pH值控制在6-8.5之间。正式试验前先做预试。然后在最高安全浓度与最低全致死浓度范围之间，按级差设5-7个组，每组养10尾，并设空白对照。供试水用曝气去氯后的自来水，标明水质指标；供试农药用纯品，必要时也可用工业品或制剂；难溶于水的农药，可用超声波加以分散，或用低毒的丙酮与吐温-80助溶，用量要10ppm为低毒农药，1.0-10ppm为中毒农药，0.1ml/L，试验液的浓度按级差设5-7个组。另设一对照组，每组用水蚤20只，分4槽，每槽5只。槽中药液用量不得2ml/只蚤。试验期不投食，对照组中水蚤的死亡率应控制在0.1ml/L。试验用的农药溶液按级差设5-7个组，另设一个空白对照。开始时试验液中的藻量控制在105个细胞/ml左右，pH7.50.2，水温222，连续光照（光强4000勒克斯），采用振摇或间歇振摇下培养96小时，于24、48、72、96小时时取出少量培养液，测定藻数变化，用概率统计法求出相应时间内的半抑制浓度EC50与95%的可信限值。