生物工程开题报告物料预处理对酶法提取灵芝多糖的影响.doc

毕业设计（论文）开题报告书课 题 名 称 物料预处理对酶法提取灵芝多糖的影响 学 生 姓 名 学 号 系、年级专业 生物与化学工程系11级生物工程 指 导 教 师 2014年12月1日 一、课题的来源、目的、意义（包括应用前景）、国内外现状及水平1课题的来源结合工程实际和社会实践，指导老师给定2 课题研究的目的和意义灵芝是我国医学宝库中的一味非常珍贵的中药，含有很多药品的有效成分，其中灵芝多糖就是从灵芝中提取的一味具有强化人体免疫功能、抗衰老、抗肿瘤以及清除自由基的一种非特异性免疫刺激剂1。由此对灵芝中有效成分的提取即成为一项具有重大意义的工程，目前社会上新出行的高效降压茶其有效成分即为灵芝中的灵芝多糖，但是由于灵芝多糖的提取率不高，导致灵芝多糖价格的昂贵，所以为了加大高效降压茶的有效成分灵芝多糖的产量，满足社会群众的需要，最大限度的对灵芝多糖的提取，针对灵芝多糖的提取工艺提出改善，观察物料预处理是否对灵芝多糖的提取率产生影响，并提高灵芝多糖的提取率成为了一门尤为重要的工艺23。3 国内外的现状及水平 由于灵芝多糖有许多保健作用和药理作用，因此可用于开发健康人、肿瘤患者、肝病患者、高血压、高血脂、糖尿病患者所需要的保健食品。如可将灵芝多糖加入固体食品，加入茶、咖啡、啤酒中制成风味独特的饮品，这些都是目前最有开发前景的功能食品。灵芝多糖具有疗效明确、无任何毒副作用等特点，已被用作临床治疗肿瘤的辅助药物4。目前开发的灵芝类产品有灵芝多糖口服液，灵芝多糖冲剂、片剂，针剂，灵芝酒，四维灵芝液，灵芝醋，灵芝胶囊、灵芝茶、灵芝精粉、灵芝孢子粉等。传统的灵芝多糖提取方法是采用水提醇沉法，利用灵芝多糖能溶于水、稀碱、稀酸，不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点，从灵芝子实体中提取多糖。传统的提取方法耗时长、耗用溶剂量大、温度过高，容易使多糖发生分解5。近年来，超声波、微波以及酶技术在活性成分的提取中的应用，超临界流体辅助提取法、超滤法以及其他高新技术的发展也为高效、快速地提取灵芝多糖提供了更多新选择。 酶法提取：沈爱英等比较了热水浸提法、碱浸提法、酸浸提法、复合酶法浸提等多种提取方法提取姬松茸子实体多糖。结果表明，采用复合酶法浸提，即采用由纤维素酶、果胶酶和蛋白酶按一定比例组成的复合酶，对姬松茸子实体在45 酶解40 min，然后升温至85热水浸提l h，多糖提取率为15167% ，所需时间为单纯热水浸提的一半，而提取率明显高于水浸提，也高于酸、碱浸提6 。而且采用复合酶法提取能保持天然产物的构象，不破坏其生物活性。崔蕊静等研究了银耳多糖的多种提取工艺，结果表明，酶法浸提效果最佳，碱浸提法其次，两者均优于热水浸提法。酶法提取缩短了提取时间，同时又提高了有效成分的提取率，具有很大的应用价值。利用复合酶解法结合热水浸提法提取香菇多糖，与传统热水浸提法相比，提取时间缩短了一半，提取率提高2倍。酶解法反应条件温和，能保持天然产物的构象，不破坏其立体结构和生物活性，有利于保持有效成分原有的药效。比如有些植物药经过醇处理以后，其有效成分发生了不同程度的改变或丢失，影响了中药制剂的药理作用和疗效。再如在有些含特定立体旋光的真菌类多糖的提取中，有时需要用酸处理，由于酸能破坏多糖的苷键，形成较多的单糖和低聚糖，从而使多糖含量降低 78。 酶解法在原工艺基础上仅增加一个操作单元，而勿须对原有工艺进行大的改变，而且操作简便易行，对设备的要求不高。近几年有人提出“仿生提取”的构想。它模拟人体胃、肠的内环境，提出用人工胃液、人工肠液在低温下提取中药，并且引进酶催化，使药物转化成人体易综合利用的活性混合物酶法的引入有利于实现低温下中药有效成分的提取。酶法提取过程一般分成两个步骤，一是酶解处理，用酶降解细胞壁和胞间连接物；二是提取有效成分，然后通过提高温度使酶失活，再用溶剂浸提有效成分。酶法提取的影响因素和优化：酶的种类和配比中药材的品种不同，其生物体细胞结构和有效成分也有很大的差异。因此，在酶类的选择方面，必须根据实际情况选用合适的酶类，以达到最佳的提取效果。目前，采用的酶类主要是纤维素酶和果胶酶，此外也有中性蛋白酶等910。超声波提取：超声波提取法是采用超声波辅助溶剂进行提取，声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏植物药材的细胞，使溶剂渗透到药材细胞中，缩短提取时间，提高提取率1112。超声波提取法是采用超声波辅助溶剂进行提取，其特点为超声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用破坏植物药材的细胞，使溶剂渗透到药材细胞中缩短提取时间，提高提取率 1、可作生物和植物细胞破碎；2、可作生物和植物有效成份萃取；3、可作中草药有效成份的低温提取；4、可作BCR元素形态萃取；5、低能量状态可激活细菌；6、高能量状态可杀死活细菌；7、可用于DNA提取和DNA剪切；8、可用于基因导入；9、可用于原酒的催陈处理；10、可用于打破植物种子的休眠状态，以提高出芽率和早熟期；超声波提取优点：1、提取效率高；超声波独具的物理特性能促使植物细胞组织破壁或变形，使中药有效成分提取更充分，提取率比传统工艺显著提高达50-500%。2、提取时间短：超声波强化中药提取通常在2440分钟即可获得最佳提取率，提取时间较传统方法大大缩短2/3以上，药材原材料处理量大；3、提取温度低：超声提取中药材的最佳温度在4060，对遇热不稳定、易水解或氧化的药材中有效成分具有保护作用，同时大大节能能耗；4、适应性广：超声提取中药材不受成分极性、分子量大小的限制，适用于绝大多数种类中药材和各类成分的提取；5、提取药液杂质少，有效成分易于分离、纯化；6、提取工艺运行成本低，综合经济效益显著；7、操作简单易行，设备维护、保养方便。超临界流体辅助提取法：与传统提取方法相比，利用超临界流体萃取技术提取中药有效成分具有许多独特的优越。超临界流体萃取兼有精馏和液液萃取的某些特点。溶质的蒸气压、极性及分子量的大小均能影响溶质在超临界流体中的溶解度，组分间的分离程度由组分间的挥发度和分子间的亲和力共同决定。一般情况下，组分是按沸点高低的顺序先后被萃取出来；非极性的超临界CO2流体仅对非极性和弱极性物质具有较高的萃取能力；超临界流体萃取在临界点附近操作，因而特别有利于传热和节能。这是因为当流体接近临界点时，气化潜热将急剧下降。在临界点处，可实现气液两相的连续过渡。此时，气化潜热将急剧下降。在临界点处，可实现气液两相的连续过渡。此时，气液两相界面消失，气化潜热为零；超临界流体的萃取能力取决于流体的密度，因而可方便地通过调节温度和压力来加以控制，这对保证提取物的质量稳定是非常有利的；超临界萃取所用的萃取剂可循环使用，其分离与回收方法远比精馏和液液萃取简单，且耗能较低。实际操作中，常采用等温减压或等压升温的方法，将溶质与萃取剂分离开来；当用煎煮、浓缩、干燥等传统方法提取中药有效成分时，一些活性组分可能会因高温作用而破坏。而超临界流体萃取过程可在较低的温度下进行，如以CO2为萃取剂（临界温度为31.1)的超临界萃取过程可在接近于室温的条件下进行，因而特别适合于热敏性组分的提取，且无溶剂残留。超滤法：超滤是一种膜分离技术，在多糖提取过程中，用超滤膜能够从水或其他液体中分离出分子量不同的胶体和大分子物质。采用超滤技术对多糖进行分级，具有收率高、重复性好、能耗低、设备简单、无污染、不破坏多糖的生物活性等优点。在分离分子量相对较大、分布范围较宽、溶液粘度大、不稳定的多糖时优势更加明显。并且超滤膜在长期连续使用的情况下也可以保持较恒定的产量和分离效果1314。自20世纪60年代以来，陆续有研究表明一些真菌中的多糖具有显著的药性且无细胞毒性，应用前景广阔1。多糖的定量测定在多糖类药物质量控制中具有极其重要的作用，但是因为多糖研究起步比较晚，所以其测定方法以及提取过程中存在的影响因素尚存在很大的不足。近年来郭利平15，陈超琴16，范晓良17等，这些学者在多糖的研究方面都做出了很大的贡献，但是他们重点大都是在多糖的提取工艺上，而忽略了多糖提取前，材料的预处理对多糖提取的影响。故本实验从老师所给的几点影响因素入手，参考近五年的有关多糖提取方面的文献，结合历年来不同学者从不同方面对多糖测定方法的研究，讨论预处理对酶法提取灵芝多糖的几点影响，同时对不同问题提出自己的看法，以期为工业上预处理对酶法提取灵芝多糖的影响因素的选择提供依据。二、课题研究的主要内容、研究方法或工程技术方案和准备采取的措施1、课题研究的主要内容以灵芝子实体为原料，利用考查物料的粒度、扰动、烘烤和紫外线处理等因素对酶法提取灵芝多糖的影响；采用正交试验设计考察探讨物料粒度、扰动、烘烤和紫外线处理等因素对酶法提取效果的影响；（1） 将灵芝进行物料预处理（2） 用酶法进行灵芝多糖的提取（3） 进行灵芝多糖收率的计算（4） 进行实验结果的分析总结 2、研究方案和准备采取的措施2.1实验材料与仪器2.1.1 材料：灵芝2.1.2 主要试剂与仪器 无水乙醇；葡萄糖；浓硫酸；5苯酚溶液；80乙醇溶液；0.5%纤维素酶 高速冷冻离心机；紫外-可见光分光光度计；烘箱；电子天平；中药粉碎机 2.2实验方案灵芝子实体主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，三者通过形成束状晶体结构或木质素结合层使灵芝子实体具有较强的硬度。但灵芝多糖存在于子实体细胞内壁，提取较为困难，因此采用粒度和扰动处理、烘烤处理、紫外处理三种预处理方式，由曹泽虹，高明侠等做的酶法提取灵芝多糖的工艺研究实验可知：纤维素酶加酶量0.5%，酶解时间80 min，酶解温度55 ，pH5.0；果胶酶加酶量0.5%，酶解时间80 min，酶解温度40 ，pH4.5；植物蛋白水解酶加酶量1.0%，酶解时间60 min，酶解温度55 ，pH4.5。三种酶相比，纤维素酶提取灵芝多糖效果最好，多糖提取量达197.49 mg/100 mL。纤维素酶法、醇沉法、纤维素酶法+醇沉法3种方法提取灵芝多糖含量比较，纤维素酶法+醇沉法提取效果最佳，多糖含量达211.21 mg/100 mL故本实验采取纤维素酶法+醇沉法提取，纤维素酶加酶量0.5%，酶解时间80 min，酶解温度55 ，pH5.0，料液比为1:15，在此基础上探究物料粒度、烘烤温度以及紫外照射时间对酶法提取灵芝多糖的影响。2.2.1灵芝粉的制备：灵芝子实体挑选、清洗烘干至恒重粉碎过筛灵芝粉2.2.2 灵芝多糖提取工艺流程： 灵芝粉单因素物料预处理锥形瓶酶法提取减压抽滤滤液定容测多糖含量进行然后减压浓缩醇沉离心真空干燥粗多糖 2.3灵芝多糖含量的测定：2.3.1试剂浓硫酸；无水乙醇；5苯酚溶液；80乙醇溶液2.3.2 多糖含量检测方法采用苯酚- 硫酸法测定糖含量。灵芝多糖在浓硫酸的作用下，先水解成单糖，单糖迅速脱水形成糖醛衍生物，然后与苯酚结合为有色化合物，在490 nm处有最大吸收。2.3.3 标准曲线的绘制配制葡萄糖标准溶液：精确称取干燥成恒量的葡萄糖25mg，加适量水溶解，转移至250mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，配成质量浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准储备液。再吸取0.5、1、3、5、7mL分别置于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，配成质量浓度为0.05、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL 的标准使用液。配制5%的苯酚溶液：准确称取5g苯酚，用移液管（或滴定管）量取95mL水加入苯酚中，不停搅拌，完全溶解后，将溶液转入棕色细口瓶中，存入冰箱备用。绘制标准曲线：准确量取蒸馏水2.00mL和葡萄糖标准溶液2.00mL，置于干燥的具塞试管中，加入5%苯酚溶液1.00 mL，摇匀，置于冰水中，然后立即加入浓H2SO4 5.00mL，充分摇匀，室温放置15 min后置于100 沸水中水浴加热15 min，取出再置于冰水中15min，以加蒸馏水的溶液做空白，在490 nm 处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度（mg/mL） 为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸光度- 葡萄糖质量浓度的关系曲线，可得线性方程。 2.3.4 灵芝多糖得率的计算 样品测定：吸取样品液2.0mL按2.5.3中步骤操作，测吸光度，通过标准曲线计算样品液浓度，根据下式计算多糖得率。因为样品都定容在250mL容量瓶中，稀释倍数是相同的，所以测得的吸光度的大小可以看出多糖得率的高低。多糖得率（%） = CDV/W 100%其中：C 为被测液质量浓度（mg/mL），D 为稀释倍数；V 为总体积（mL）；W 为投加原料质量（mg）。2.4 单因素实验：2.4.1 烘烤温度对灵芝多糖提取率的影响18精确称取 2.0g 灵芝粉，置于250mL锥形瓶中，然后将的物料放入烘箱设备中烘烤温度（70、75，80、85，90）一定时间，取出锥形瓶，处理后的灵芝粉降至室温时，按料液比 1:15加入适量的水，0.5%的纤维素酶，调pH为5.0，酶解80min，然后按照上述提取工艺流程得到灵芝粗多糖，计算得率，考察不同的烘烤温度下酶法提取灵芝多糖得率的影响。2.4.2 物料粒度对酶法提取灵芝多糖的影响1920精确称取 2.0g 灵芝粉，将称取好的灵芝粉分别通过50，60，80,100,150目筛，然后将通过不同大小目筛的灵芝粉分别用标记好的锥形瓶装好按料液比 1:15加入适量的水，0.5%的纤维素酶，调PH为5.0，酶解80min，然后按照上述提取工艺流程得到灵芝粗多糖，计算得率，考察在不同物料粒度下酶法提取灵芝多糖得率的影响。2.4.3 紫外线照射时间对酶法灵芝多糖提取率的影响精确称取 2.0g 灵芝粉，置于250mL锥形瓶中，在超净工作台下完成，按料液比1：15浸润40min，将浸润后的物料放于紫外线下照射（25min,30min，35min,40min，45min）处理后将样液取出，按料液比 1:30加入适量的水，0.5%的纤维素酶，调PH为5.0，酶解80min，然后按照上述提取工艺流程得到灵芝粗多糖，计算得率，考察不同时间的紫外线照射对酶法提取灵芝多糖得率的影响。2.5 正交优化试验设计为了确定各因素对多糖提取效果的影响大小,对以上三个因素进行了正交试验。因素水平表见表2.1：2.6 最佳方案的确定根据正交试验，选出提取率最高的最佳优化方案。表2.1 正交试验表所在列 1 2 3因素 烘烤温度 紫外照时间 物料粒度 灵芝多糖得率（） （min） （目） （%）实验11 1 11 2 21 3 32 1 22 2 32 3 13 1 33 2 13 3 2实验2实验3实验4实验5实验6实验7实验8实验9 三、现有基础和具备的条件（1）充分查阅了相关文献；（2）论文实验设计方案已经确定；（3）知道实验方案的有关原理以及操作能力；（4）实验室具备物料预处理所需的实验基本器材和药品。 （5）学院图书馆有相关文献资料。 （6）指导教师具有指导毕业论文的经验，能够为毕业实验的设计方案以及可行性提供建设性意见。 参考文献1郭志烨,韩丽,杨明等. 中药多糖定量测定方法的探讨J. 中成药,2014,10:2172-21762李阳,赵春玲,王晓晓等. 酶法提取枸杞多糖的工艺研究J. 广州化工,2014，183李亚辉，马艳弘，黄开红等响应面法优化复合酶提取芦荟多糖工艺及其抗氧化活性分析J. 食品科学,2014，184董汝晶. 多糖提取方法的研究进展J. 农产品加工(学刊),2014,08:46-48.5董玉玮,苗敬芝,曹泽虹等. 酶法提取灵芝多糖的工艺研究J. 食品科技,2009,06:217-2206王洪云,李铭. 石斛多糖的药用功能研究进展J. 环球中医药,2014,10:817-820. 7敖锐，吴天祥，付红伟超声波协同复合酶法提取灰树花菌丝体多糖的工艺优化J.贵州农业科学，2014,088于泽源,滕歆,徐雅琴等. 复合酶法提取树莓果实多糖工艺优化的研究J. 东北农业大学学报,2014，039王智慧. 真菌多糖的研究J. 神州,2012,17:34. 10刘洁,李文香,王文亮,徐同成,刘丽娜,陶海腾,杜方岭. 生物多糖研究进展J. 山东农业科学,2011,05:98-101.11王小梅. 超声对麦冬多糖结构、溶液行为及生物活性影响的研究D.陕西师范大学,2013.12严碧歌,赵凯,杜柯. 超声波提取对麦冬多糖结构和抗氧化活性的影响J. 压电与声光,2011,06:859-86213张红兵,胡云霞,赵士豪等. 微生物多糖提取、分离和纯化方法的技术策略J. 中国老年学杂志,2014,11:3210-321314贾琳璐,王岸娜,吴里根. 植物多糖的提取及分离的研究进展A. International Science and Engineering Center, Hong Kong、Wuhan Institute of Technology, China.Proceedings of 2010 First International Conference on Cellular,Molecular Biology, Biophysics and Bioengineering(Volume 7)C.International Science and Engineering Center, Hong Kong、Wuhan Institute of Technology, China:,2010:4. 15郭利平，仙人掌多糖的分离纯化、结构和生物活性研究进展中国食品添加剂，2010,0316陈超琴，蒋丽华，赵黎明等石斛多糖的研究进展，食品工业科技2014,0217范晓良，颜继忠，阮伟峰香菇多糖的提取、分离纯化及结构分析研究进展海峡药学2012,0518钱志伟，王会晓，杨海蛟，酶法提取马齿苋多糖，中国农学通报2011,27(05):475-47819刘冬燕,古滨河,高俊,柳云龙. 激光粒度仪测定浮游植物粒径的可行性研究J. 水生生物学报,2014,06:1185-1189.20杨志超. 粉末粒度分布对烧结钕铁硼微观结构形成的影响J. 山西冶金,2014,05:11-13四、总的工作任务，进度安排以及预期结果1总的工作任务通过仔细查阅相关文献，根据已经设计好的实验方案，进行多次实验，确定物料预处理对酶法提取灵芝多糖的影响。2进度安排1 2014年11月5日2014年12月5日查文献资料并写好开题报告。2 2014年12月6日2015年4月30日完成所有实验。3 2015年5月1日2015年5月20日写好毕业论文，并准备答辨。3预期结果紫外线可能使物料中水解灵芝糖苷的酶发生了变性（烘烤处理中, 红外线也有类似作用, 只是能量稍弱）, 从而尽可能避免了灵芝糖苷在提取中的水解，提高了总灵芝多糖得率。烘烤在物料预处理中具有重要的作用。它能改变物料的组成, 如通过裂解或聚合生成某些特殊成分, 还能对物料的质构变化起到一定作用, 主要是通过改变细胞纤维素结构, 从而改变物料内部原有有效成分的扩散路径, 使之变得畅通, 利于浸提过程的进行，从而提高总灵芝多糖的得率。物料颗粒在吸收提取溶剂膨胀后, 将延长总灵芝多糖的扩散路径，通过不同物料粒度的选取，了解最适粒度，从而提取灵芝多糖的得率。五、指导教师审阅意见指导教师（签名） 年 月 日 六、教研室审查意见教研室主任（签名） 年 月 日 七、系审查意见主管系领导（签名） 年 月 日 备 注