米根霉生长环境对产有机酸的影响机制开题报告.doc

南京林业大学毕业设计(论文)开题报告 学生姓名陆阳学 号120204111专 业生物工程指导教师姓名李鑫职 称副教授所在学院化学工程学院选题来源科研课题选题类型毕业论文选题名称米根霉生长环境对产有机酸的影响机制研究的目的及意义 以米根霉为出发菌株，研究米根霉利用葡萄糖生产有机酸的过程，发酵条件的变化对产有机酸的影响机制，研究米根霉生长环境的变化对产有机酸的影响，为生物转化制备有机酸，提供数据依据。国内外同类研究概况富马酸作为重要的四碳平台化合物之一，已经被美国的能源部列入优先发展的十二种平台化合物之一，由于世界资源日益紧缺，寻找廉价的制备富马酸的方法成了我们目前急需解决的问题。研究内容及计划以米根霉为出发菌株，研究pH值的变化对米根霉产富马酸和L-苹果酸的影响，并优化产酸的米根霉发酵条件。2016.1-2016.3 文献检索，资料准备，开题报告及探索性实验2016.4-2016.5 分步实验2016.5-2016.6 补充实验，撰写论文及论文答辩特色与创新1、研究米根霉的发酵条件变化对产富马酸的影响。2、讨论诱变条件使富马酸产量变化的原因。指导教师意 见 指导教师签名： 年 月 日1研究背景 随着科学技术的不断发展和社会的进步，人类对于自身的生存环境和资源利用越来越重视，特别是食品的安全问题以及石油资源的开发问题，这都和人类的长期发展息息相关，而这就不得不提到富马酸这种物质。富马酸作为重要的四碳平台化合物之一，已经被美国的能源部列入优先发展的十二种平台化合物之一1。富马酸(Fumaric Acid)，又名延胡索酸(Fumarate)或反丁烯二酸(Trans-Butenedioic Acid)，是生物体内一种重要的中间代谢产物，另外它在医药、涂料、树脂、增塑剂等领域方面也有重要作用。甚至是一种可以用作食品添加剂和饲料添加剂的重要的有机化工原料。富马酸味道纯，酸度恰好是柠檬酸的1.5倍，它不仅没有毒副作用，而且在防腐抑菌方面有重要作用，是近些年来最新型的食品调味剂之一。并且我们可以通过富马酸经过酶法转化的方法来制备L-苹果酸和L-天冬氨酸，二者都是重要的食品添加剂，尤其是L-苹果酸，它是目前世界排名前列的酸味剂，开发前景巨大。随着人们对日益枯竭的化石资源的开发，研究利用可再生生物资源制备富马酸成为我们的必经之路。由于世界粮食价格较往年呈上涨趋势，使得发酵法生产富马酸的方法成本随之而增加，所以寻找廉价的制备富马酸的方法成了我们目前急需解决的问题。2 文献综述2.1 富马酸的结构及理化性质富马酸(Fumaric Acid)是最简单的不饱和的C4二元羧酸，它的结构式见下图它有两个羧基，一个双键。它的分子式为C4H4O4，分子量116.07。富马酸为白色颗粒，结晶状，有微酸气味，没有毒性，具有可燃性，可稳定存在于空气中，密度1.635 g/cm3，熔点299300 ，在290 时升华，富马酸可溶于乙醇溶液，在水和乙醚中微溶，在二氯甲烷中极微少可溶。其中在水中溶解度为0.63 g/100 mL，富马酸即反丁烯二酸2，它和顺丁烯二酸是几何异构体，反丁烯二酸经过加热到250-300 可转变为顺丁烯二酸，富马酸经高锰酸钾氧化还可以生成外消旋酒石酸。图1 富马酸结构式2.2富马酸的用途富马酸在医药、涂料、树脂、增塑剂、食品添加剂和饲料添加剂方面都有重要应用。在医药方面，富马酸盐可以用来治疗严重的银屑病，它还可以防止多发性硬化症，它还可以用于生产解毒药二疏基丁二酸，它的反应产物还可以用于治疗小红血球型贫血病，富马酸盐对人体的健康很有好处。它能改善牛皮癣的病症，人体的皮肤在阳光照射下能自然产生富马酸。富马酸盐常与左旋肉碱一起运用，帮助身体产生对我们有利的物质。此外，富马酸盐对锻炼的恢复也有一定作用。在涂料方面，它是生产电泳漆的原料。它可以生产不饱和聚酯树脂，这类树脂具有耐热和耐化学腐蚀性能好的优良品质，工业级富马酸可生产醇酸树脂。富马酸与乙酸乙烯的共聚物又可以作为实用的粘合剂，它与苯乙烯的共聚物又可用来制玻璃钢，由富马酸所制得的增塑剂没有毒性，乙酸乙烯乳胶与食品接触时需要用到它。富马酸盐还可以使染料轻易地粘在织物上，生产服饰和毛毯3。富马酸在食品方面的用途尤其广泛，并且具有广阔的发展前景。总的来说，富马酸可用作酸度调节剂、酸化剂、抗氧化助剂、腌制促进剂、香料、发酵粉等。富马酸以酸味剂的身份作为食品添加剂的一种，广泛应用于我们的日常生活中，例如凉茶类饮料、果味糖类、果冻类和布丁类制品、冰淇淋制品等，富马酸与柠檬酸味道相似，它与NaOH反应生产的单钠盐，也是酸味剂，另外它还可以用于肉、鱼制品的加工等。富马酸与NaCO3反应生成的富马酸钠是一种独特的风味增强剂，它还是生产木糖醇的一个重要成分。2.3 富马酸的制备方法目前，富马酸制备方法主要有化学合成法和生物合成法。其中化学合成法主要是通过苯的催化氧化作用生产富马酸，但这一方法面临的难题是石油资源日益短缺的问题以及对环境产生的巨大污染。这使得我们的关注点放在了微生物发酵法制备富马酸的研究上，研究表明很多微生物都可以用于制备富马酸，如霉菌、酵母和细菌。尤其是根霉，它需要的营养条件简单，适应力强，生长迅速，适合用于实验室研究等优良品质4。本次实验就是研究米根霉对富马酸生产的影响。2.3.1 化学合成法富马酸的化学合成法又分为顺丁烯二酸酐（顺酐）异构法和糠醛氧化法。前者在合成树脂、涂料、农药、润滑剂、医药产品、纸张处理剂、食品添加剂、稳定剂等方面需求量大，该方法以顺酐为原料，以苯法和正丁烷法为主要方法，催化剂为KBr-H2O2体系，产率93，具有少用量，运输便携，不腐蚀设备等优点，缺点是石油资源的紧缺5。 糠醛是水解农林副产品而获得的有机化工原料，它覆盖面广，生活中它在医药、农夜、纺织、颜料、塑料、绝缘材料、粘合剂、食品添加剂、合成树脂和橡胶等产业都有着十分广泛的用途。它是以糠醛为原料，植物纤维原料经水解提纯的方式，以V2O5为催化剂，它的产率为83，具有污染小，副产物可回收作为肥料的优点，缺点是成本高。化学合成法制备富马酸目前面临的最大的问题就是，资源的衰减速度大于我们对石油资源的开采，而且环境压力也日益增大，我们在利用资源生产富马酸的同时，也在产生着巨大的污染，破坏了生态的平衡。2.3.2 生物合成法富马酸的生物合成法又分为酶催化转化法和微生物发酵法。酶催化转化法，一般以马来酸为底物，在马来酸异构酶的催化作用下产富马酸。这种方法具有高转化效率和高产率。微生物发酵法，主要以霉菌发酵产富马酸，但是由于早期的技术水平还不够，导致人们对微生物的生长代谢不够了解。是工业化生产的实际可行性滞后的原因。再加上石油危机的加重，人们更加关注微生物发酵法制备富马酸的研究。可以用来制备富马酸的微生物有霉菌，酵母和细菌。其中，米根霉就是富马酸发酵常用的菌种之一，米根霉具备淀粉糖转化的能力，且所需的发酵营养物简单，适应力强，生长又快，菌丝和发酵液易分离，提取方便,产物纯。本实验即使用米根霉产富马酸6。2.4 利用米根霉发酵产富马酸2.4.1 米根霉的简介米根霉属真菌中的接合菌门、接合菌纲、毛霉目、毛霉科、根霉属。菌落或疏松或稠密， 起初显白色，后转变为灰（黑）褐色。菌丝甸甸爬行，无色，米根霉的假根发达，分枝呈指状或根状，显褐色。抱囊梗直立或稍微弯曲，与假根对生，有时膨大或分枝，褐色，长2102500 m，直径518 m。囊轴呈球形或近球形或卵圆形，呈淡褐色，直径30200 m囊托呈楔形。抱子囊呈球形或近球形，老后呈黑色，直径60250 m抱囊抱子呈椭圆形、球形或其他形，呈黄灰色，直径58 m。在3740 能正常生长，最适合生长的温度为37 。米根霉可以利用淀粉等廉价原材料，营养需求简单，菌丝体大且易分离，对富马酸的精制有显著提升作用，是国内外目前研究火热的发酵生产菌7。米根霉是中国药和酿酒的重要霉菌，常见于土壤及空气。能糖化淀粉、转化蔗糖 ，产生乳酸、富马酸和微量酒精。它还具有很强的淀粉酶活力，常用于酒类及豆制品的发酵。 图2 米根霉2.4.2 米根霉发酵产富马酸的代谢途径富马酸是TCA循环中的中间产物，而根霉菌的代谢过程中富马酸则是通过其他途径积累的。米根霉在葡萄糖的代谢模型中存在2条富马酸合成途径。一个是通过线粒体里的三羧酸循环，琥珀酸在琥珀酸脱氢酶的作用下生成富马酸，富马酸可以借助于转运系统通过线粒体膜进入胞液,也可在富马酸酶催化下继续反应生成苹果酸。另一条途径存在于细胞液中，丙酮酸羧化酶是TCA还原途径的关键酶之一，通过催化固定化CO2与丙酮酸反应生成草酰乙酸，草酰乙酸在苹果酸脱氢酶的作用下生成苹果酸，苹果酸再经富马酸酶的催化生成富马酸8。 分析两种途径，后者途径的富马酸理论得率远高于线粒体途径的理论得率。不难看出，胞液途径是富马酸的主要合成途径。为了提高富马酸的实际得率,我们需要加大胞液途径的代谢流，此外也不能过多地减少线粒体途径，因为线粒体途径产生的能量占细胞生长和合成物质所需要能量的绝大部分。 图3 米根霉中富马酸的代谢途径所以我们要保证能量获得充足的情况下，合理调整代谢网络，多增加胞液途径的代谢通量来获得较高的转化率。2.4.3米根霉发酵条件优化2.4.3.1发酵时间经过不同时间的发酵，米根霉产得的富马酸产量大约在120小时后趋于平稳，合成富马酸速度大幅衰减，所以可以确定米根霉最优的发酵时间大约是120小时左右9。2.4.3.2碳氮源碳源：微生物对碳的需求很大，因为细胞内的干物质里碳大约占一半 ，从 CO2、碳酸盐等这些简单的无机物，到糖的衍生物、脂类等这些复杂的有机含碳的化合物，都可以作为微生物的碳源来源。米根霉是异养型微生物，它们能利用多种有机化合物为碳源。研究人员使用单因子变量的方法测葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖，可溶性淀粉等8种碳源对米根霉产富马酸含量的影响，最后得出结论：以可溶性淀粉作为碳源时,富马酸产量最高。氮源：氮源作为微生物合成氨基酸、蛋白质、核酸和细胞质的主要营养成分，是微生物生命活动中不可缺少的部分。可以使用在培养基中的氮源一般分为有机氮源（酵母膏、蛋白胨等）和无机氮源（尿素、硫酸铵）等，研究人员研究发现酵母粉，蛋白胨，牛肉膏，柠檬酸铵等氮源及氮源浓度对米根霉生长环境产富马酸的影响。氮源为蛋白胨时，富马酸产量最高10。总结得出，当以可溶性淀粉为碳源时，氮源为蛋白胨时，此时米根霉为最优产富马酸条件，富马酸产量45 g/L。2.4.3.3温度温度作为影响微生物酶活性的重要因素，能够影响米根霉的代谢产物积累，经考察不同温度对米根霉产富马酸的影响，得出28 为最适发酵温度，在这个温度下，富马酸产量最高，能达到42 g/L。2.4.3.4 pHpH是影响微生物生命活动和正常生长的重要条件，它还能影响酸性发酵产物的积累。Taos等人研究了不同pH值对米根霉的影响及产富马酸量的影响。得出米根霉的发酵最适pH为6.5左右，此时富马酸产量最高，为43 g/L。2.4.3.5 诱导剂实验中，我们还可以通过添加诱导剂的方式提高米根霉产富马酸的含量。我们可以添加不同体积分数的苹果浸出液，在米根霉培养基中加入2 %的苹果浸出液时富马酸产量提高4 g/L，提高了10 %，还可以添加不同浓度的L-苹果酸，在发酵培养基中加入1.5 g/L的L-苹果酸，富马酸产量提高5 g/L，提高了13 %，由此可见，添加诱导剂对米根霉产富马酸有显著提升作用。2.4.3.6 中和剂在发酵过程中，随着反应进行，酸不断积累，培养基中pH值不断降低，大约24小时后可以降低到3以下，而米根霉不能忍受高浓度的酸,这严重影响了米根霉的菌丝体生长和酶活性，但是我们可以通过加入中和剂的方法，中和溶液的pH值，解决这一问题，Taos等人研究了碳酸钙、碳酸氢钠、氢氧化钙等用作中和剂对米根霉产富马酸的影响，得出发酵液中加入过量碳酸钙时,富马酸产量最高,达到37 g/L，效果明显。2.4.4影响富马酸产量的因素2.4.4.1种子液pH研究种子液pH对米根霉菌体形态、生物量发酵产富马酸量的影响。种子液的pH能影响米根霉的菌体形态,却对生物量影响作用小。种子液pH为2.1时，孢子不能萌发，pH 2.3 2.7时，可形成直径大约500 600 m的分散菌球,能在培养基中保持球形，pH 2.9时，形成一种菌球和絮状菌丝的混合物，在培养基中呈相互缠绕的絮状，pH 3.1 3.3时形成絮状种子，在发酵过程中呈团状;培养基pH高于3.3时，形成紧密缠绕的菌丝体团块状，在培养基中保持团块状。将不同菌体形态的种子在其他条件相同的情况下，进行发酵培养，测定富马酸产量，结果显示，球状形态下，富马酸量最高，平均质量浓度可达55.2 g/L，比絮状和团状形分别高60 %和112 %，因此,种子培养基中pH控在2.3 2.7内，有利于富马酸产生11。2.4.4.2 孢子密度孢子密度影响着米根霉菌球的大小，而菌球的大小又对富马酸的生成影响巨大。向pH 2.5的培养基中接种孢子，增大其密度，在发酵条件相同的情况下，研究其对菌体形态和富马酸产量的影响，在研究浓度范围内菌体形态均呈球状，但菌球直径、数目和富马酸产量随着密度的变化而存在明显差异。培养基中生物量呈增涨趋势，菌球的直径减小，数目增加,富马酸产量提高。研究得出，接种米根霉的孢子密度应控制在1.5 108 3.0 108 个/L最适12。2.4.4.3 钙离子浓度钙离子是影响菌丝顶端生长的重要因素,而且钙离子表面所带的正电荷能抑制细胞间的排斥作用，增进细胞间交联。我们在培养基中加入少量CaCl2，观察它对菌球直径、生物量以及米根霉相应富马酸产量的影响,结果是，添加0.5 g/L CaCl2在培养基中，菌体生物量明显有所增加，平均菌球直径由0.53 mm增加到0.62 mm，富马酸产量增至58.9 g/L，与之前相比提高了5.9 %。随着CaCl2添加量不断加大，富马酸生成量几乎不变化了。可以得出结论,培养基中加入钙离子有助于富马酸的生成13。3 总结本次实验的目的是以米根霉为出发菌株，研究米根霉利用葡萄糖生产富马酸的过程，发酵条件的变化对产富马酸的影响机制，研究米根霉生长环境的变化对产富马酸的影响。从目前的发展趋势来看，随着我们日益对石油资源的开采以及环境的破坏，我们所生活的环境已经不堪重负，寻找并合理运用安全环保的方法制备富马酸成了我们丞待解决的重要问题。利用生物法生产富马酸工艺简单，天然无毒，安全有保障，市场前景无比广阔，我们应该加大生物法制备富马酸的研究，选育优良菌株，改进生产工艺流程，提高富马酸得率和效率，降低成本，推动社会经济环境的同步发展。同时，通过科学技术创新来寻求新型的处理技术，完善和开发更加高效、无污染且成本低的处理技术，将是今后生产富马酸的发展趋势。4 参考文献1 Pietrzak, W., Kawa-Rygielska, J.,. Simultaneous saccharication and ethanol fermentation of waste wheatrye bread at very high solids loading: Effect of enzymatic liquefaction conditions. Fuel,2015, 147, 236-242. 2田毅红,雷照方,刘海军.富马酸的发酵工艺研究J.三峡大学报.2007, 29(04):0371-0373. 3 Lei Huang,Peilian Wei,Ru Zang,etc. High-throughput screening of high-yield colonies of Rhizopus oryzae for enhanced production of fumaric acidJ. Ann Microbiol, 2010, 60(10):0287-0292. 4 Y. Zhou,J. Du,G. Tsao. Comparison of fumaric acid production by Rhizopus oryzae using different neutralizing agentsJ , Ann Microbiol ,2002,35(10):0225-0230. 5 Ying Zhou,Jianxin Du,George T. Tsao. Mycelial pellet formation by Rhizopus oryzae ATCC 20344J, Ann Microbiol ,2000 ,40(55):0345-0350. 6李鑫, 马瑞, 赵晗璐, 等.米根霉利用纯糖和不同预处理玉米秸秆酶解糖生产 L-乳酸J.生物加工过程, 2010,0 8(06):0112-0123. 7 臧茹. 富马酸生产菌株米根霉的菌种选育及培养条件的优化文D .浙江大学,2007. 8 张昆,徐晴,李霜等.复合诱变筛选丙烯醇抗性的富马酸高产米根霉菌株J.安徽农业科学, 2008 ,36(23):98239825. 9 李霜,徐晴,黄和.发酵法制备富马酸的关键技术及其进展J.生物加工过程,2013,11(02):0052-0058. 10 刘宁,李霜,何皓,等少根根霉利用木糖和葡萄糖分步发酵制备富马酸J.过程工程学报,2008,08(04):07160719. 11徐晴, 高振, 付永前,等.米根霉ME-F12 发酵产富马酸的菌体形态控制J, 生物加工过程, 2009,07(02):0048-0052. 12 Narra, M., James, J.P., Balasubramanian, V. Simultaneous saccharication and fermentation of delignied lignocellulosic biomass at high solid loadings by a newly isolated thermotolerant Kluyveromyces sp. for ethanol production. Bioresour. Technol. 2015,179, 331-338. 13 陈晨, 邰超, 李霜. 米根霉发酵产富马酸的最适替代中和剂及pH调控策略研究J. 中国生物工程杂志, 2013, 33(4): 85-91.