课题申报书-大鼠慢性高氧肺损伤.doc

报告正文（一） 立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1、 项目的立项依据随着机械通气、表面活性物质替代疗法等新技术应用，危重新生儿、尤其是早产儿存活率已显著提高。然而，长时间吸入高浓度氧，幸存者易发生肺部氧化应激损伤。目前，高氧肺损伤已成为发达国家NICU最为棘手的问题之一和婴儿慢性肺疾病的最常见形式。但高氧肺损伤的确切机制尚未完全阐明，更无有效的防治手段。因此深入研究其发病机制，积极防治高氧肺损伤，具有优生优育、提高人口素质的战略意义。高氧肺损伤是一个涉及许多细胞活动的复杂过程，可分为早期的组织损伤（弥散性肺泡炎）和晚期的损伤后修复（肺间质重构）两个过程。细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的重建参与了高氧肺损伤的整个病理过程，若ECM重建正常，则损伤完全修复，肺结构正常；若ECM重建紊乱，将导致肺纤维化。因此，ECM重建是关系高氧肺损伤结局的关键因素。本实验室在国内外率先开展了对早产大鼠高氧肺损伤中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和其抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)表达的研究，已发现肺损伤时MMPs过度表达、MMPs/TIMPs失衡是ECM重建紊乱发生纤维化的关键原因 1（具体研究成果见研究基础栏）。有关MMPs在高氧肺损伤中的作用已为少数国外学者所重视，但高氧肺损伤后ECM重建过程中，引起MMPs过度增加的具体机制是什么？本实验室拟从MMPs的诱导剂和抑制剂两方面深入研究。细胞外基质金属蛋白酶诱导剂（extracellular matrix metalloproteinase inducer,Emmprin）在上调MMPs表达中起关键作用。Emmprin是分子量为58KD的质膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，不仅表达于正常组织，还表达于肿瘤组织如肺部肿瘤细胞，提示Emmprin参与体内生理及病理过程2。目前，少数文献已证明，体外Emmprin与人成纤维细胞共培养后，成纤维细胞MMPs表达增加。进一步研究表明，Emmprin在细胞表面与自身受体或MMP结合，激活胞内MAPK p38信号通路，该途径激活促进ECM降解3，4。但关于Emmprin/MAPK p38对MMPs调节的研究仅限于肿瘤细胞，有关高氧肺损伤后肺ECM重建过程中，Emmprin如何调控MMPs/TIMPs平衡，目前国内外尚无文献报道。转化生长因子（Transforming growth factor beta, TGF-）在下调MMPs表达中起关键作用。研究证明TGF-刺激可使肺成纤维细胞MMPs生成减少5。另有研究发现，TGF-抑制元件位于MMP-1基因启动子区，严密调控MMP-1在不同生理和病理情况下的表达6。进一步的研究表明，TGF-对MMP-1的作用通过SMAD信号途径介导，该途径激活可阻止ECM降解5。因此，推测TGF-/SMAD对MMPs/TIMPs平衡的调节可能是影响肺损伤后ECM重建的关键因素之一。有关高氧肺损伤后肺ECM重建过程中，TGF-如何调控MMPs/TIMPs平衡，目前国内外尚无文献报道。近年来对信号转导系统的研究发现，位于大多数细胞质膜上约50-100nm大小的囊性凹陷结构小窝（caveolae），是许多信号分子完成跨膜信号转导的“驿站”。小窝蛋白（caveolin）是小窝胞浆面包被的一种21-24kD的膜蛋白，是许多信号分子活性状态的重要调节者。在无胞外信号刺激下，caveolin通常与富集于小窝质膜上的各种信号分子、受体及非受体型酪氨酸激酶等相结合，抑制这些信号物质的活性；在激动剂与受体结合后，caveolin分子构象发生变构或共价修饰，调节信号物质的活化状态，参与信号转导调控7。有关caveolin在肺ECM重建中的作用，有学者提出肺泡型上皮细胞caveolin表达缺失可能是发生肺纤维化的亚细胞指标。对caveolin-1基因敲除小鼠的研究，肺组织显示肺泡隔因细胞增殖而增厚和肺纤维化。caveolin-1在肺发育的不同阶段，可表达于不同血管和上皮细胞，呈时相分布8。研究发现，caveolin 1与TGF-型受体（TR）相互作用，抑制TGF-介导的SMAD-2和下游分子的磷酸化，从而调节信号转导9。Emmprin具有酪氨酸蛋白激酶活性，且其信号传导为酪氨酸磷酸化依赖的MAPK p38途径，申请者推测caveolin能与Emmprin相互作用，调控Emmprin介导的MAPK p38和下游分子的磷酸化。简图如下：胞外信 caveolin +? caveolin/Emmprin作用 Emmprin/MAPK p38号刺激 变构活化 + caveolin/TR作用 TGF-/SMAD信号整合 调控肺ECM重建 基于上述，申请者提出如下假设：高氧暴露下MMP诱导剂/抑制剂失衡是高氧肺损伤MMPs增加，ECM重建紊乱的主要原因。高氧暴露使质膜小窝表达或功能异常，从而影响Emmprin/MAPK p38和TGF-/SMAD两条信号通路整合，继而导致MMPs增加，ECM重建紊乱。本人所在的研究室属呼吸系统疾病重点实验室。多年来，本人一直致力于新生儿高氧慢性肺损伤的研究，已成功建立了早产大鼠高氧肺损伤的动物模型、掌握了支气管肺泡灌洗术、体外型肺泡上皮细胞和成纤维细胞培养、核酸、蛋白分析等技术，并对抗氧化酶、细胞因子水平、一氧化氮、MMPs/TIMPs失衡等因素在高氧肺损伤发病机制中所起的作用进行了较深入的研究，同时应用地塞米松、维甲酸、人类重组促红细胞生成素、EGb761进行了抗氧化损伤的干预研究（见研究基础栏）。这些理论研究和技术方法的积累为本课题的开展奠定了坚实的基础。 本研究如能完成，可望为探索高氧肺损伤后肺ECM重建紊乱的机制开拓新思路，并为寻找有效的预防和干预高氧肺损伤提供依据。 参考文献1. Taylor PM, Woodfield RJ, Hodgkin MN et al.Breast cancer cell-derived EMMPRIN stimulates fibroblast MMP2 release through a phospholipase A(2) and 5-lipoxygenase catalyzed pathway. Oncogene 2002 Aug 22;21(37):5765-722. Liang L, Major T, Bocan T.Characterization of the promoter of human extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN). Gene 2002 Jan 9;282(1-2):75-863. Lim M, Martine T, Jablons D. Tumor-derived EMMPRIN(extrocellular matrix metalloproteinases inducer) stimulates collagenase transcription through MAPK p38. FEBS Lett 1998;441(1):88924. Yuan W, Varga J. Transforming growth factor-beta repression of matrix metalloproteinase-1 in dermal fibroblasts involves Smad3. J Biol Chem 2001;276(42):38502-105. White LA, Mitchell TI, Brinckerhoff CE. Transforming growth factor beta inhibitory element in the rabbit matrix metalloproteinase-1 (collagenase-1) gene functions as a repressor of constitutive transcription. Biochim Biophys Acta 2000 Feb 29;1490(3):259-686. Razani B, Zhang XL, Bitzer M, et al. Caveolin-1 regulates TGF-beta/SMAD signaling through an interaction with the TGF-beta type I receptor. J Biol Chem 2001;276 (9):672767387. Ramirez MI, Pollack L, Millien G, et al. The alpha-Isoform of Caveolin-1 Is a Marker of Vasculogenesis in Early Lung Development. J Histochem Cytochem 2002;50(1):33428. Drab M, Verkade P, Elger M, et al. Loss of caveolae, vascular dysfunction, and pulmonary defects in caveolin-1 gene-disrupted mice. Science 2001;293(5539):2449522、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。研究目标：建立早产大鼠慢性高氧肺损伤模型，探讨Emmprin与TGF-调节失衡是否为高氧肺损伤MMPs增加，ECM重建紊乱的主要原因；探讨小窝蛋白对Emmprin/MAPK p38和TGF-/SMAD两条信号通路整合的影响，为高氧肺损伤发生机制和寻找有效防治措施提供理论依据。研究内容：1. Emmprin/MAPK p38信号通路活化状态及高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的相关性： 研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中Emmprin、P38、磷酸化P38的表达。 研究高氧肺损伤Emmprin/MAPK p38信号通路活化状态与MMPs表达双变量关系。2. TGF-/SMAD信号通路活化状态及高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的相关性： 研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中TGF-、TR、SMAD、磷酸化SMAD的表达。 研究高氧肺损伤TR的激酶活性，计算磷酸化SMAD与非磷酸化SMAD比值。 研究高氧肺损伤TGF-/SMAD信号通路的活化状态与MMPs/TIMPs的双变量关系。3. caveolin-1对Emmprin/MAPK p38和TGF-/SMAD两条信号通路及其与高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的相关性： 研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中caveolin-1表达及酪氨酸磷酸化水平。 研究高氧肺损伤肺组织质膜小窝内caveolin-1与Emmprin的共定位。 研究高氧肺损伤肺组织质膜小窝内caveolin-1与TR的共定位。拟解决的关键问题：1. 成年动物急性高氧肺损伤模型，因其肺发育已成熟，不能如实反映不成熟肺的损伤情况，并且与临床上早产儿需长期用氧情况差异较大。本项目采用早产大鼠慢性高氧肺损伤模型，能更如实模拟支气管肺发育不良的发生情况。虽然此模型技术难度较大，但本研究组在早产大鼠模型制备方面已积累了丰富经验，能成功完成此模型的复制。2. 本研究假设caveolin与Emmprin的相互作用可调控Emmprin/MAPK p38信号通路活化；caveolin-1与TR的相互作用可调控TGF-/SMAD信号通路活化。以往由于技术条件限制，未能从形态学上直接证实。借助共聚焦显微镜观察和荧光双重标记技术可解决这一技术难题。3、 拟采取的研究方案及可行性分析。研究方法： 本课题采用共聚焦显微镜（confocal microscope）、免疫荧光双重标记和免疫组织化学等研究方法，辅以蛋白质与核酸分析技术（Western Blot、Northern Blot方法），检测各指标的动态变化，并对各指标进行定位、定性、定量分析。1.建立早产大鼠慢性高氧肺损伤模型： 参照申请者著作，实用儿科临床杂志，.检测caveolin-1酪氨酸磷酸化水平： 应用抗caveolin-1pAb 进行免疫沉淀 应用抗磷酸化酪氨酸mAb 进行Western Blot分析. 检测肺组织中Emmprin、P38、磷酸化P38 、TGF-、TGF-型受体（TR）及SMAD-2、磷酸化SMAD表达，探讨高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的分子机制： 蛋白质水平检测Western Blot。 mRNA水平检测Northern Blot（或RT-PCR）。 . 检测肺组织中TR的激酶活性： TR分离提取免疫沉淀法（immunoprecipition） TR与纯化的激酶底物GST-SMAD2（由美国国立癌症研究机构de Caestecher, M教授提供）反应，应用免疫印迹法检测磷酸化SMAD2水平，计算TR的激酶活性。. 检测肺组织质膜小窝内caveolin /Emmprin及caveolin-1/TR的共定位及表达：样本制备： 制备组织切片加入抗caveolin mAbPE标记的二抗加入抗Emmprin/TR的pAbFITC标记二抗 共聚焦显微镜（TCSSP型，德国Leica公司）检测共定位；应用图象分析软件对caveolin表达强度进行半定量。应用统计学方法处理数据：应用SAS统计分析软件，对数据进行统计学分析。技术路线： 早产大鼠高氧肺损伤模型caveolaecaveolin酪氨酸磷酸化状态（免疫沉淀、免疫印迹） Emmprin/MAPK p38 TGF-/SMAD信号通路研究信号通路研究Emmprin、P38、磷酸化P38TGF-、TR、SMAD、磷酸化SMAD表达（免疫印迹与Northern Blot 表达（Western Blot和Northern Blot）或RT-PCR)TR激酶活性（免疫沉淀和免疫印迹）caveolin/Emprin共定位 (荧光双标记、共聚焦显微镜)caveolin/ TR共定位 (荧光双标记、共聚焦显微镜)可行性分析：1. 申请者所在的研究室属于呼吸系统疾病重点实验室临床二室，本室在慢性阻塞性肺疾病和肺纤维化发病机制的研究领域已有大量工作积累，为本项目的研究打下了良好的工作基础。申请者及所在研究室在产儿高氧损伤领域进行了一系列开拓性研究，已熟练掌握急、慢性高氧肺损伤模型复制，蛋白、核酸分析等技术。（详见研究基础栏）2. 本项目研究的主要成员之一，香港合作者教授，是国际上新生儿肺损伤研究的前沿科学家，目前与本研究小组密切合作，进行有关慢性肺损伤研究。霍泰辉教授除承担实验指导，并提供部分试剂。3. 新一代共聚焦显微镜具有观察亚细胞结构的立体定位功能，用其检测在体组织caveolin/Emmprin、caveolin/ TR信号分子在亚细胞位点的共定位表达，虽无文献报道，在技术上难度较大，但申请者已掌握了多种荧光标记技术，应用共聚焦显微镜观察caveolin-1在细胞质膜上的定位表达也已获成功。申请人所在单位的医学中心的共聚焦显微镜和本实验室的基本研究设备，能保证本实验研究完成。4、 本项目的特色与创新之处。理论上的创新：u 研究Emmprin/MAPK p38信号通路在器官发育和组织病理损伤中的作用,国内外尚无文献报道。u 本课题研究caveolin对Emmprin/MAPK p38、TGF-/SMAD共调节机制，将为早产儿高氧肺损伤发病机制开辟新的研究领域，并为其防治开拓新思路。方法上的创新：以在体组织为研究对象，应用免疫荧光双重标记共聚焦显微镜技术研究caveolin/Emmprin、caveolin/TR共定位，国内外未见文献报道，可望为深入研究小窝蛋白对信号转导的调控机制开辟新途径。5、 年度研究计划及预期研究结果。年度研究计划及预测进展 本课题研究内容预计用3年时间完成. 2004年1月8月购买所需试剂。建立预实验动物模型。进行各项预实验。 2004年9月2005年2月 建立动物模型。完成标本的收集。 2005年3月7月 完成MMPs、TIMPs、TGF-、TR、SMAD2及其mRNA表达的研究，并进行阶段性总结。 2005年8月2005年12月 完成caveolin-1表达和caveolin-1/TR共定位研究，并进行阶段性总结。 2006年1月2006年6月 完成caveolin-1的酪氨酸磷酸化状态研究，并进行阶段性总结。 2006年7月12月 研究数据资料分析、总结、论文撰写及成果鉴定。 预期研究成果本项目所建立的早产新生大鼠慢性高氧肺损伤模型，不仅为本课题提供了研究对象，而且为研究高氧肺损伤后肺ECM重建提供了模型。本研究可望为阐明早产儿高氧肺损伤机制提供新的线索：高氧暴露下MMP诱导剂/抑制剂失衡是高氧肺损伤MMPs增加，ECM重建紊乱的主要原因。高氧暴露使质膜小窝表达或功能异常，从而影响Emmprin/MAPK p38和TGF-/SMAD两条信号通路整合，继而导致MMPs增加，ECM重建紊乱。本研究内容也可能为预防和干预高氧肺损伤提供理论依据。（二）研究基础与工作条件1、 工作基础1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩本课题组多年来一直进行高氧肺损伤的发病机制及防治的研究，做了许多基础和临床研究工作。已成功建立早产新生大鼠高浓度氧（85%95%）急性肺损伤和慢性肺纤维化的模型；已完成肺组织中各种抗氧化酶活力、羟脯氨酸含量与肺纤维化的相关性研究；内源性一氧化氮在高氧肺损伤中双重作用的研究；体外高氧对肺泡巨噬细胞分泌IL-8的影响研究；TGF-在早产大鼠高氧肺损伤肺组织中表达的研究；基质金属蛋白酶及其抑制剂在高氧肺损伤中的作用机制的研究；及促红细胞生成素、地塞米松、维甲酸对新生鼠高氧肺损伤的干预研究。获奖课题目前正承担的相关科研项目：1. 2. 相关研究工作发表的文章：附：基质金属蛋白酶及其抑制剂在高氧肺损伤中的作用1. 高氧组病理学改变 2. 高氧组MMPs表达 图1 肺发育不良，示肺泡 图2 细胞增生、间质纤维 图3 MMP-2强阳性表达数目减少、结构简单 化改变3. 酶谱法测BALF中明胶酶活性 4. 高氧暴露后MMPs、TIMPs表达增加 MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-23d O2 0.460.36 0.900.64 2.000.47 0.300.23 air 0.070.10 0.070.16 0.870.58 0.030.087d O2 1.330.60 0.110.45 2.600.71 1.150.34 air 0.360.43 0.170.35 1.700.35 0.060.1014d O2 3.400.53 2.750.66 3.370.45 2.430.18air 1.300.90 0.330.31 2.820.89 0.080.1021d O2 3.730.46 3.350.60 3.880.11 1.900.38air 0.300.14 0.600.10 2.540.55 0.300.14图4 高氧组条带亮度增强，示活性增强 高氧组与对照组比较均P0.05 2、 工作条件1) 研究所需实验动物，均有实验合格证。2) 申请者所在医院的分子医学中心设备可协助完成Western blot 、northern blot、免疫沉淀等实验。3) Caveolin-1抗体由Division of Hematology/Oncology/BMT Department of Pediatrics Emory University School of Medicine教授有偿提供。本项目所需的其它抗体、分子探针和试剂国外均有售，或由合作者Fok TF赠送。总之，申请人所在的医院及大学的实验条件，完全能够满足该项目的研究要求。3、 申请人简历4、 承担科研项目情况1 由本项目申请者负责。 主要探讨EGB761对高氧肺损伤早产新生大鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子如TNF-、IL-8，IL-1、IL-6、MMPs、TIMPs及其 mRNA的影响。2早产儿贫血临床治疗的研究 由本项目申请者负责。3支气管肺泡灌洗技术在新生儿肺部疾病中的应用研究 “新技术、新业务”资助项目。登记序号： 项目编号：中医药、中西医结合科研项目课题设计书课题名称：痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机理研究申报单位： 江苏省中医院课题负责人： 朱萱萱计划年限：邮政编码： 210029 联系电话： 8661714130306申报日期：江苏省中医药局制填写提纲一、立项依据：与选题直接相关的国内外现状、水平和发展趋势；选题的理论和实践依据；研究目的、意义；本研究达到的科学技术水平，预期社会经济效益和应用推广前景。二、科研假说或技术构思，主要研究内容、关键技术、目标（达到的主要技术指标或技术经济指标），技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。三、研究试验方法及技术路线（工艺路线）。四、现有工作条件和基础：开展本项研究的技术优势，现有的主要仪器设备及应用合格实验动物的基本条件等；已有工作基础，预试验情况。五、计划进度：根据总的研究期限、年度计划进度，分别列出具体的目标和进度的考核指标。六、参加（协作）单位意见及具体分工（附协议书）。七、经费概算（包括其他部门的拨款、贷款、自筹记忆取得的自主）和核算依据，以及分年度使用计划。填写说明一、内容填写自备附页，用纸大小和封页一致，字迹清楚，装订整齐后按申报要求上报。二、填写提纲所列内容，要全面详细、如实填写。三、封面上“登记序号”“项目编号”请勿填写。1、 立项依据1.1 研究目的、意义骨关节炎（osteoarthritis，OA）又称退行性关节病，以关节软骨发生弥漫性龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的一组临床征候群，是多见于中年以后的慢性进行性关节疾患。该病发病率随年龄增长而升高，据调查，在美国目前2亿多人口中，就有骨关节炎4500万，发病率占总人口的20%，在老年人中所占比例更高，50岁以上人群中，OA的患病率仅次于心血管疾病，位居第二位。在我国，根据流行病学调查显示，5564岁的人群中发病率达40%，而65岁以上人群的患病率达60%90%。随着计划生育政策的长久实施及经济发展，我国已进入老龄化社会，OA的发病率还将越来越高，这不仅严重危害人民的生活、健康，对社会也将造成很大负担。同时世界其他国家也面临着同样的问题，因而OA引起了国际、国内医学界的相当重视。近年来对OA的研究颇多，在发病机制、检测手段以及治疗方法上均取得较大进步，但总的来说还缺乏令人满意的突破性进展。西药治疗OA的主要手段是非甾体药，但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点。虽然中药治疗OA也取得了一些经验，但对其具体的作用机制有深入研究的却很少，因此在中医理论的指导下，运用现代科学技术，对疗效确切的中药复方进行深入的机理研究，使中药治疗OA的疗效在国际先进行列中占一席之地，是摆在我们面前非常重要的课题。1.2 国内外现状水平和发展趋势近十年来，国内外对OA进行了较深入地研究，大致归纳如下：1.2.1 流行病学研究已广泛开展在近100种不同类型的关节疾病中，OA是影响人类健康最常见的关节疾患之一，没有明显的种族和地域差异，本病的患病率随年龄增加而增高，故随着人类平均寿命的延长，患病率也有增高的趋势。Felson等报道70岁以下人群膝OA患病率为7%（男6.4%，女11.4%），80岁以上为11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射学膝OA70岁以上为27.4%（男30.4%，女25.1%），80岁以上为43.7%。Butter等报道，44岁以下、4559岁、60岁以上人群中，放射血OA 患病率各为6.2%、21.6%和42.0%。国内陈顺乐等队13541名钢铁工人的调查结果显示，症状性OA患病率2.2%；无症状性OA患病率53%，其中3039、4049、5059岁患病率各为11%、27%和62%。汕头大学医学院统计551例，结果40岁以下、4049、5059和60岁以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同关节OA易感性不同。美国在卫生统计中心调查结果，OA患病率以手最高，以下依次为足、膝、髋。国内陈顺乐等调查结果OA是颈椎最多，以下依次为腰椎、膝、手和腕。本病性别差异在脊柱差别不大，但手、膝、髋OA均以女性较多，且女性骨关节炎的遗传易感性较男性高。在Framingham的研究中，Felaon等发现女性体重减少11磅，骨关节炎形成的风险相应减少50%。 Saase等调查结果，膝OA患病率男、女峰值分别为24.7%和54.6%。根据1994年统计，在美国，骨关节炎的消耗为155亿美元，约为类风湿关节炎的3倍，其中一半以上消耗缘于工作丧失。在我国虽未作全国大范围的普查，但随着老龄化社会进程的不断加快，OA的发病率会越来越高，这必将给家庭、社会带来沉重负担。1.2.2 病因、发病机制有了巨大突破目前基础研究认为软骨的损伤与退变是OA的根本，随着分子生物学免疫学的发展，近年来众多学者对OA关节软骨退行性改变的原因从不同角度进行了大量研究，其发病机制仍未完全明了，又提出了许多学说，如软骨下骨内高压学说：由于骨血液动力学的改变，在骨髓腔容积不变的前提下增加内容物引起压力增高，即表现为骨内压力增高。骨内高压持续增高存在下关节滑液pH值下降，成分改变，干扰并破坏了软骨细胞的正常代谢导致细胞变性坏死，胶原纤维解聚，蛋白多糖分解，软骨下骨破坏、修复，最终产生骨性关节炎。自由基学说：认为自由基对软骨细胞DNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用软骨细胞后，引发膜脂质过氧化，使脂质过氧化代谢产物丙二醛增多，丙二醛可与DNA发生交联，自由基也可直接攻击软骨细胞DNA即合成DNA所需的酶，使DNA链断裂、碱基损伤从而影响了DNA的合成，也造成前列腺（PG）合成障碍。骨关节炎时，滑膜、滑液、血管翳内常有中性白细胞、巨嗜细胞浸润，其表面受免疫复合物、补体等作用能释放大量O2-和H2O2；细胞因子学说：细胞因子对骨关节炎的发生、发展起了重要作用，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子（TNF）等在OA中水平明显增高。IL-1具有刺激软骨细胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎症和疼痛，同时IL-1也是软骨基质降解的主要驱动因子；软骨酶降解学说：OA软骨细胞的基质降解酶类的合成与分泌率明显增加，并与关节炎的严重程度密切相关。参与降解基质大分子的降解酶类可以增加达到几倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基质金属蛋白酶，尤其是基质溶素和胶原酶，参与关节软骨的降解过程，这些酶类可以降解细胞外基质的所有成分，与循环系统中的纤维蛋白溶酶和局部合成的纤溶酶原一起，快速降解软骨。在滑膜细胞和软骨细胞产生的IL-1和TNF的作用下，软骨细胞以酶原的形式分泌大量的基质金属蛋白酶，而对金属蛋白酶组织抑制剂无影响，使二者失衡从而增加对软骨主要成分型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使软骨进行性破坏；一氧化氮学说：NO是一种细胞间信使分子，可介导许多生物学现象。NOS可催化重要炎性介质NO的产生，OA患者血清、滑液中NO含量明显高于正常。NO可通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，改变蛋白多糖和胶原蛋白的合成与分泌功能，同时使软骨细胞分泌透明质酸减少，滑膜粘蛋白解聚，抑制软骨细胞合成软骨基质，促进软骨细胞糖酵解，使软骨破坏。细胞凋亡学说：细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，许多正常组织均可发现凋亡，但凋亡亢进与不足则会引起相关疾病，在骨关节炎患者软骨中软骨细胞的凋亡有异常表现，且凋亡细胞数目与骨关节炎严重程度明显相关。凋亡小体存在于软骨细胞小孔或间隙内，其产生的焦磷酸盐能从溶液中沉积钙，有NTPPH（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和碱性磷酸酶作用,造成余下软骨细胞修复过程失败，而逐渐发展成关节软骨的完全丢失。OA软骨细胞凋亡主要通过两种相互独立的途径完成，一种是同滑膜炎症无关的途径,由NO介导;另一种是同滑膜炎症相关的途径,由Fas介导。典型的OA不存在明显的炎症反应,此时软骨细胞凋亡以NO途径为主;当产生炎症反应时,则通过as途径加剧软骨细胞凋亡和关节破坏。NO通过两种方式造成组织及细胞损伤。一是高浓度的NO能抑制多种与线粒体呼吸传递系统及柠檬酸循环有关的酶,从而抑制线粒体呼吸,造成组织损伤;二是NO与超氧化阴离子2-反应,生成氧化亚硝基阴离子ONOO-,在酸性条件下(如病理条件)迅速分解为OH-和NO2自由基,这两种自由基具有很强的细胞毒性,可造成组织细胞损伤。在OA患者中,受损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区。Fas表达的结果与其相符,OA受损区的Fas表达远高于未受损区,提示Fas表达可诱导软骨细胞凋亡。除NO途径和Fas途径外,还有一些因素可导致软骨细胞凋亡、关节破坏,如IL-1、IL-8、TNF-、PGE2、Aggrecan G1区等。1.2.3 治疗方面有了不少新方法目前中西医治疗OA的药物较多，西药治疗OA主要有三大类，第一类为快作用药，即非甾体药，特点是发挥作用快，但副作用较大，对胃肠、肝肾、血小板均有较大影响，OA多为老年人，长期服用此类药尤其不能耐受，且部分药物价格不菲，而且由于过分的镇痛，导致病人失去警惕过分运动，以致出现“消炎痛髋”，从长期疗效来看反而不佳，最新观点认为乙酰氨基酚应作为治疗OA的首选药，但尚有一定争议，且同样存在上述副作用；第二类为慢作用药，发挥作用慢，疗效不确切，价格昂贵，临床上尚未广泛运用；第三类为软骨保护剂，尚未问世。关节清理术、膝关节置换术，适应症较少，费用高，创伤大，病人难以接受。中哦药治疗OA的研究取得了可喜的进步，但中药治疗仍存在较多共性的问题：多属临床经验，无对照组，特别是西药对照组观察，处方不固定。缺乏用客观的最新的国际公认的、量化的临床观察指标及疗效判断标准为手段来寻找治疗OA的中药。未针对OA发病机制进行临床及动物试验从生化、免疫、病理、细胞分子水平来探讨中药的药物作用机理。缺乏高效的、作用综合、副作用小的新药。中医认为OA属痹症中的痹、痛痹、骨痹，认为其病因与年老体衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关，明确指出肝肾亏虚、气血不足、筋骨失养为OA的发病基础，而寒湿、痰瘀为病理因素及病理产物。周尊谦等人在传统中医理论基础上，阐述了膝OA骨内高压血瘀证氧自由基之间的密切关系；谢林等论述了膝OA与血瘀证之间的内在联系，旨在为运用活血化淤药治疗OA提供理论依据。治疗方面从古到今绝大部分医家皆针对其病因病机采用益肝肾、强筋骨、补气血治其本；散寒通络、化痰胜湿治其标。独活寄生汤是用于治疗风寒湿痹、关节疼痛和脑血管后遗症的传统固防，具有补肝肾、活血通络之功，临床常见本方加减治疗OA，疗效比较肯定。朱健儿以本方加味治疗262例，总有效率94.7%。单文龙等用本方加减治疗骨关节炎24例，有效率为87.5%。陆智报道用本方加减治疗104例，总有效率91.3%。1.2.4 实验研究方面有了较大的进展随着对OA发病机理的不断深入认识，对OA的实验研究方面也开始了向多层次多角度的方向发展。动物实验不再只局限于微循环和一般抗炎、镇痛试验，现已使用针对OA的动物实验，并采用相关的指标进行检测。目前实验研究内容主要有以下几个方面，研究最多的是OA的血液流变学、氧自由基及一氧化氮含量等，这些试验一般均可通过建立骨关节炎的模型来完成，也可通过使用其它相似的模型检测相关指标来进行，如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标，使用老龄动物通过检测体内SOD及MDA含量推断药物的抗氧自由基的能力等。在NO对OA影响的实验中，一般采用硝酸还原酶法来测定NO含量，运用PT-PCR技术测定NOS基因表达。IL-1、IL-6、TNF等细胞因子、软骨降解酶尤其是基质金属蛋白酶、诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原/纤溶酶原激活物和前列腺素PGE2、软骨细胞的细胞凋亡及增殖情况、性激素水平等也越来越多地被作为检测指标使用到实验研究中来。1.3 选题的理论和实践依据祖国医学并无骨关节炎的病名，从历代文献来看本病应归属于“骨痹”、“痛痹”范畴。我们认为OA病人除了肝肾亏虚，寒湿痹阻外，一般OA病人体重超重较多，也即为痰湿偏盛之体，另外脾虚生湿及寒湿痹阻日久湿聚成痰，痰淤交阻是引起膝关节肿胀畸形、活动受限的重要因素，所谓顽症怪病皆质之于痰淤。基于现代医学对OA发病机理的深入研究，我们在补益肝肾、活血通络基础上，结合中药对缓解软骨降解，增加软骨细胞功能，抑制滑膜增生及炎症的研究成果，于1995年即对备急千金要方中的独活寄生汤进行化裁，重用活血化淤，加用化痰清热之品，总结制定出了高效、药源广泛、安全可行的痛痹颗粒，并于1999年采用痛痹颗粒的组方治疗膝OA，方中以独活为君药，以祛下焦与筋骨间风寒湿邪；威灵仙舒筋通络止痹痛；淫羊藿、怀牛膝补肝肾，强筋骨，通经络，其中怀牛膝为引经药；当归养血柔肝、舒筋活血；川芎则通达四肢关节，为血中气药；虎杖活血清热解毒，同时防诸药辛燥太过。诸药合用共起补肝肾、祛风湿、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保护软骨。通过36例的临床研究、观察，结果表明本方疗效显著且副作用小。因此有必要对痛痹颗粒治疗骨性关节炎的作用机制尤其是该方对软骨细胞的细胞凋亡与增殖机理做进一步的研究，冀能证实痛痹颗粒的临床疗效，明确其作用机制，并初步探讨本病发病的可能机理，为新药问世提供客观的依据，所以进行设计并立题。1.4本研究达到的科学技术水平，预期社会效益和应用推广前景1.4.1继承和发扬祖国医学，保持中医特色，以临床疗效为前提，以实验研究为基础，制造规范化大鼠的膝OA模型，从发病机理探讨本药的作用机制。本实验采用可靠地国际公认的方法复制动物模型，并采用最新的检测指标IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，总之本研究基于现代医学对OA发病机制的最新研究成果，从生化、免疫等多个角度多个层次，系统观察并进行归纳总结，确保本课题不但可行而且先进，冀能填补省内外运用中药治疗OA的空白，并希望以此为基础，进一步从细胞水平（包括本药对软骨细胞及细胞凋亡与增殖的影响）研究中药对OA的长久作用及影响，从而达到挤身国际先进水平的目的，让中药真正走向世界。1.4.2目前，中药治疗OA的方法颇多，但大多以临床疗效研究为主，大样本、规范化的研究很少，中医中药治疗机理的研究，虽有涉及，但大多分散且存在一定的重复性，理想的治疗药物尚未问世，具有公认疗效的小儿迁延性腹泻临床治疗方案尚未确立，其疗效评价体系尚需研究确定，尤其是缺少中医药治疗学整体研究思路与方法，使中药复方治疗OA的疗效机理尚未能全面揭示，影响了该领域研究的深入。而痛痹颗粒是在中医理论指导下选用千金要方中独活寄生汤进行加减所得，并采用可靠的实验模型及最新的国际公认的相关指标进行实验研究，观察其对OA的确切疗效及作用机理，这必将对OA的中医理论产生较大影响，同时对临床治疗也起到更好的指导作用，从而产生较好的社会经济效益。随着改革开放的形势发展，以及中国加入WTO与国际接轨的进程的不断完善，祖国医学国际地位不断的提高，我们将从祖国医学宝库中发掘出的治疗OA的高效药物与现代新技术、新方法进行研究总结，从而为人类造福，为振兴中医事业做出应有的贡献。2.科研假说或技术构想：主要内容、技术关键目的，技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。2.1主要内容2.1.1探讨OA的病因病机，提出新见解，发展中医理论。2.1.2运用现代科学技术，开展实验研究，从分子生物学、免疫学、生理生化学等多方面来探讨“痛痹颗粒”治疗膝OA的疗效机制及药理毒理作用。2.2主要技术关键2.2.1膝OA模型的复制目前所使用的OA动物模型一般可分为两大类，其一是诱发模型，即通过各种操作方法如制动、手术、关节内注药、关节内植入软骨碎片或微粒等诱导OA产生；另一类为自发模型，即不用任何外界干预，动物自发OA，如C57黑鼠等。在选择动物模型时一般应考虑动物的种属（包括其生活习性、关节结构、组织学及病理学特征）、不同方法的造模机制和OA模型的特点，并应参照研究目的加以选择。在诱发模型中，常用的方法是手术造成关节的应力改变及关节腔内注入木瓜蛋白酶， 这两种方法都能复制出较成功较高的OA模型，且操作较为简单。具体的造模机制在于低应力可以造成软骨厚度减少，SO染色变淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度损伤等变化，木瓜蛋白酶作为一种蛋白水解酶会引起关节软骨的退行性改变。在具体的造模过程中我们选用以上两种方法来分别复制动物模型。用于动物模型的动物一般有狗、兔、鼠等，我们选用大鼠做OA模型，因为该模型关节软骨退变的组织学特征与人类相似，且动物来源较广泛，且经济。2.2.2关节软骨细胞的获取和培养基于来源广泛，操作可行的原则，目前用于体外培养的软骨细胞一般均为兔关节软骨细胞原代培养所得。软骨需在严格无菌的条件下分离，经过一系列的漂洗、消化等工作后获取软骨细胞。目前还没有专门用于软骨细胞培养的培养液，国外采用的培养液种类繁多，有199、1640、F12、改良Eagle等，国内的有199、1640、DMEM（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用DMEM培养液居多。在培养液中还含有一些辅助添加剂，包括25mmol/L Hepes、1mmol/L 丙酮酸钠、2mmol/L 谷氨酰胺、50umol/L 二硫基乙醇以及10万单位/L的青霉素和10万单位/L的链霉素，PH7.4。培养过程中一般使用5%CO237的恒温培养箱。2.2.3采用的检测手段及指标在病理组织形态学的检查中，一般采用以下几个观察指标：大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况；HE染色观察有关的形态变化；Masson三色染色观察胶原的变化；Sanfranin-O即沙红O染色用于组织学评分，评分方法按Mankin法；电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。在细胞培养的相关检测中，我们采用MTT法检测软骨细胞的增殖能力，用全自动生化分析仪对检测总蛋白含量，使用细胞流式仪进行细胞凋亡的测定，对iNOS、NO含量的测定则使用分型NOS试剂盒和NO试剂盒。2.3目标（达到的主要技术指标或技术经济指标）、技术特征及创新之处。现代科学技术与中医药理论相结合，深入研究中医药治疗OA的作用机制，为临床应用提供更加科学有利的客观依据，发挥中医药治疗OA的特色和优势，为临床常见、严重影响人类健康的OA研究出有效、安全、便于推广应用的中医药治疗方法，使能迅速缓解症状，大大减轻病人痛苦，降低膝骨关节炎的致残率和复发率，且副作用小的简、便、廉、验的中药制剂问世。治疗膝OA的新药生产及对其在治疗中所起作用机制的深入探讨，既符合国情又能够走向世界，产生较大的社会和经济效益，这必然形成高新技术产业进入高新领域，对促进科技进步，发展中医药，有着积极的作用，同时这也是中药现代化研究的发展方向和新的探索。3.实验研究方法及技术路线。3.1对实验性大鼠骨性关节炎的防治作用 OA模型的制备：（1）取SD雄性大鼠50只，体重200220g，固定，常规备皮消毒，沿髌韧带内侧缘切口，切断双后肢内侧副韧带及膝前内侧筋膜扩张部，并在断端处修剪去除约2mm，造成双后肢膝外翻畸形。术后第二天放造模大鼠于拖箱内每天赶其行走30m。（2）取SD雄性大鼠50只，体重200220g，4%木瓜蛋白酶溶液与0.03mol/L半胱氨酸溶液1：1混置0.5小时后，分别在第1、3、5、7天于实验大鼠膝关节腔内注入混合液20ul。方法：将造模后的大鼠随机分为模型组、阳性对照组（维骨力组）、治疗组，另设正常对照组，分别灌胃给药或蒸馏水，连续7周。七周后将动物麻醉后，立即将大鼠以仰卧位固定，颈总取血，接入试管中，2000rmp15min离心获取含药血清；切开关节囊，进行大体观察后，然后以锐利刀片切取膝关节前正中部分的滑膜组织，作HE染色，电镜下观察。再用锐利刀片切取股骨内倮软骨使其呈2mm1mm全层软骨标本，2.5%戊二醛溶液固定，电镜下观察。所余之股骨内倮连同软骨下骨一并切下，10%福尔马林溶液固定24小时以上，分别作HE、沙红-O及Masson三色染色后光镜检查，取样后即可将动物处死。观察指标：大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况；HE染色观察有关的形态变化；Masson三色染色观察胶原的变化；Sanfranin-O即沙红O染色用于组织学评分，评分方法按Mankin法（附评分等级表如下）；电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。评分等级.结构正常 0表面结构微小不规则 1表面结构中等不规则 2表面结构严重不规则 3过渡层出现裂隙 4辐射层出现裂隙 5钙化层出现裂隙 6过渡层消失 7辐射层消失 8钙化层消失 9结构完全破坏 10.细胞1. 切线的区域正常 0细胞肿胀 1细胞消失 22. 过渡和辐射的区域正常 0少量的细胞增多 1中等量的细胞增多 2大量的细胞增多 3少量的克隆 4中等量的克隆 5大量的克隆 6少量的细胞减少 7中等量的细胞减少 8大量的细胞减少 9细胞消失 10.变异标记 完整 0多层 1模糊 2血管的交叉 3.血管翳形成没有 0少量 1中等量 2大量 33.2 对体外培养兔膝关节软骨细胞的影响