资源描述
1.杂交瘤技术制备单克隆抗体的原理、主要流程？原理：杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，这种杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，即成为能够分泌抗体并能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过克隆后成为单个细胞克隆，分泌的抗体即为单克隆抗体。流程：免疫小鼠（融合前3-4周）强化免疫（融合前3-4天）取脾细胞制成悬液（融合当天） 骨髓瘤细胞融合前2周复苏培养收集呈指数生长细胞 融合（PEG）在细胞培养板，HAT培养液中培养融合前两周改用HT培养液培养（维持1-2周）检测抗体（融合后第10、14、18天）阳性孔细胞，初次克隆化（加饲养细胞）检测抗体（克隆化后10、14天），多次克隆化阳性杂交瘤细胞在24孔培养板中扩大培养4-7天在培养瓶中扩大培养一周以上1收集培养上清鉴定；2杂交瘤细胞冻存液氮中；3杂交瘤细胞注入小鼠腹腔收集腹水提纯抗体并鉴定细胞类型正常培养基HAT培养基正常培养细胞+TK缺陷细胞+-HGPRT缺陷细胞+-杂交瘤细胞+2.为什么只有杂交瘤细胞能在HAT选择培养基中生长？ 细胞的DNA生物合成有两条途径：一条是生物合成的主要途径：即由氨基酸及其小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA，在这一合成途径中，叶酸作为重要的辅酶；另一途径为辅助途径，以次黄嘌呤和胸腺嘧啶为原料，在次黄嘌呤-鸟嘌呤核苷酸转换酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的催化作用下合成DNA。HAT培养基中含有氨基蝶呤（为叶酸拮抗剂），故所有细胞的DNA主要合成途径均被阻断，只能通过辅助进行DNA的合成。HGPRT缺陷型或TK缺陷型的骨髓瘤细胞在HAT培养基中因不能通过旁路合成DNA而死亡。脾细胞虽有HGPRT或TK，但不能再体外长期培养繁殖，一般在两周内死亡。而杂交瘤细胞因从脾细胞获得HGPRT或TK，可通过旁路合成DNA，同时又具备肿瘤细胞的特点，在体外培养中可以长期繁殖生长。所以- 3.ELISA常见的方法类型有几种？分别举例说明其检测原理和临床应用。一、测定抗原的方法： 1.竞争法：首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合物（测定管），而另一组只加酶标记抗原（对照管），再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为我们所要测定的位置抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。但需要较多量的酶标记抗原为其缺点。2.双抗体夹心法：首先用特异性抗体包被与固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待测样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为待测抗原的量。这种方法待测的抗原必须至少有两个可以与抗体结合的部位（二价或二价以上抗原），因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。3.双位点一步法：在双抗体夹心法的基础上，进一步发展了双位点一步法。测定时将受检标本与酶标抗体同时加入进行反应，经过一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。该法简便、省时，但当待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，出现钩状效应。二、测定抗体方法：1.间接法：首先用抗原包被于固相载体，加入含有被测抗体之标本，再经孵育洗涤后，加入酶标记抗抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色，底物降解的量，即为欲测抗体的量，其结果可用目测或用分光光度计定量测定，本法的优点是只要变换包被抗原，就可用同一种酶标记抗人球蛋白，进行多种人的传染病、寄生虫病以及其他疾病的血清学诊断，具有更广的通用性。其成功的关键在于抗原的纯度，另一干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。2.竞争法：当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体越少，因此阳性反应浅于阴性反应。3.捕获法：先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。在与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。4.为何常用密度1.0770.001的分层液分离人外周血单个核细胞？为何要将血液样品进行适当稀释，并叠加于分层液上？ 在外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，在1.090左右，而淋巴细胞和单核礼包密度为1.075-1.090，血小板为1.030-1.035.为此利用一种密度介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，可使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞细胞加以分离。分离人外周淋巴细胞以-最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.076-1.090之间。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细胞密度大于分层液，会凝集而沉积于管底，而血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状。 将血液进行稀释可降低血液粘稠度和红细胞的聚集，叠加于分层液上要注意液面平整，有利于离心分层，综上可以提高单个核细胞的收获量5.简述流式细胞术（FCM）的基本概念及其特点和临床医学应用.概念：以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行多参数定量分析和分选的新技术。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。特点：细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量。应用：1.淋巴细胞及其亚群的分析 2.绝对计数 3.淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 4.肿瘤耐药相关蛋白分析 5.自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 6.AIDS病检测中的应用 7.移植免疫中的应用 8.在肿瘤学中的应用 9.在血栓与出血性疾病中的应用 10.细胞内细胞因子测定。6.试述免疫印迹法检测ENA的原理ENA是可提取核抗原的总称，属非组蛋白的核蛋白，为酸性蛋白抗原，主要包括Sm，RNP等，是由许多小分子RNA与各自对应的特定蛋白质组成的核糖核蛋白颗粒，该组成使其各自的抗原性得以增强,并可因与蛋白质组成后的分子量大小各不相同而在电泳后被分成不同分子量的条带。免疫印迹法即Western blot,免疫印迹是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。原理：1.蛋白质的电泳分离：将从小牛或兔胸腔提取的ENA抗原经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度越快。按分子量大小区分成区带，经参照对应分子量标准物质确定每一抗原区带的分子量。2电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上制成抗原吸附载体膜，选用低电压（100V）和大电流（1-2A）,通电45min转移即可完成。3.酶免疫定位：将待检测血清加在已切成细条的的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）上，待测血清中存在的抗ENA抗体分别与硝酸纤维膜上的相应抗原区带结合，当再加入酶标记抗人IgG抗体后形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物，在加入酶的底物，出现显色反应，凡有抗ENA抗体与膜上抗原结合的位置，均会因酶促反应而显色。参照此时抗原区带的分子量及各区带的相对位置，可辨读出各特异性抗ENA抗体。7.化学发光免疫分析的原理和技术要点（特别要掌握检测抗原的双抗体夹心法原理）。吖啶酯作为化学发光标记物有哪些优点？原理：是用化学发光剂直接标记抗原或抗体（化学发光剂标记物），与待测标本中相应抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状态和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测。技术要点：1.分离方法：常用磁颗粒分离技术2. 免疫学反应模式：同酶发光免疫测定技术，主要也有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种主要模式，所不同只是相应标记抗原或抗体上标记的是吖啶酯而不是酶。3. 常用的实验材料：化学发光剂标记物：临床上最常用的发光剂是吖啶酯类发光剂，吖啶酯类优点：1.氧化反应不需要催化剂，只要碱性环境中就可以进行。反应物在加入H2O2后再加入氢化钠溶液，发光反应迅速，本底低；2.在氧化反应过程中，结合物被分解，因此游离的吖啶酯的发光不受抑制；3.试剂稳定性好 ；免疫磁颗粒：指由抗原或抗体包被的磁颗粒；反应试剂：指发光物所发光时所需的氧化剂（H2O2）和PH纠正液（NaOH）;定标液和质控液4. 双抗体夹心法其主要步骤为：抗原抗体反应：将包被单克隆抗体的磁颗粒和待测标本加入到反应管中，标本中待测抗原与磁颗粒上抗体结合，再加上吖啶酯标记抗体，经过温育，形成磁颗粒抗体-抗原-吖啶酯标记抗体复合物；游离和结合部分的分离：在电磁场中进行2-3次洗涤后，很快地将未结合的多余抗原和标记抗体洗去；化学发光反应：经过洗涤的磁性颗粒中，加入氧化剂（H2O2）和PH纠正液（NaOH),使其呈碱性，这时吖啶酯在不要催化剂的情况下分解并发光，由集光器进行接收，经光电倍增管放大作用，记录1秒针内所产生的光子能，这部分光的积分与被测AFP含量成正比，根据标准曲线，仪器可以自动计算出其AFP含量。8.简述TaqMan探针的技术原理热稳定DNA聚合酶Taq在具有53方向的聚合酶活性的同时，还具有对聚合延伸过程中遇到的与靶序列结合的核苷酸序列的5-3核酸外切酶活性。因此，在RCR过程中，Taq酶可利用其5核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针。利用这一特性，来检测靶序列的扩增。 根据荧光共振能量传递（FRET）原理，完整探针因荧光基团和淬灭剂距离很近而荧光基团发射的荧光被淬灭，只有当探针降解时，荧光报告基团和淬灭剂分离，这时荧光才能发射出来。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当TaqMan探针保持完整时，由于报告荧光和淬灭剂相互邻近，则荧光不能激发；RCP过程中，TaqMan探针与引物与靶序列退火；引物在Taq酶的聚合延伸下，其5外切酶活性将水解探针，从而使荧光基团脱离淬灭剂的作用而发出荧光，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。然后利用实时荧光PCR仪实时检测荧光信号，根据荧光信号与扩增循环数之间的关系以得到PCR的实时扩增曲线。9.时间分辨荧光免疫测定的原理和技术类型原理：时间分辨荧光免疫测定是用镧系稀土元素螯合物（如EU3+螯合物）标记抗体或抗原，检测标本中的相应抗原或抗体。此螯合物具有较长荧光寿命，利用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，可排除标本中非特异性荧光的干扰，所得信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧光。另一个特点是激发光与荧光的波长差别显著，其波长转变达270nm，可有效排除激发光的干扰，测得的荧光为稀土元素螯合物发出的特异性荧光信号。与一般的荧光分光光度仪不同，时间分辨荧光光分析仪采用脉冲光源（每秒闪烁1000次以上的疝灯），照射样品后即短暂熄灭，以电子设备控制延缓时间，待非特异荧光本底衰退后，再测定样品发出的长寿命镧系荧光。技术类型：1.固相双位点夹心法：是用针对抗原不同决定簇的两种特异性抗体，一种包被在固相上，另一种用Eu3+标记。标准品或待测抗原先于固相抗体反应，洗涤后再加入Eu3+标记的抗体，再次温育，形成固相抗体-抗原-Eu3+标记抗体复合物，充分洗涤后加入增强液，测定荧光强度，所测得的荧光强度与待测抗原浓度成正比。2.固相抗原竞争法：将大分子抗原直接或小分子半抗原通过化学偶联法制成半抗原-蛋白质结合物包被在固相上，成为固相抗原。待测抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，标本中待测抗原浓度越高，则Eu3+标记抗体结合到固相上的量越少，因此所测得的荧光强度与标本中待测抗原浓度成反比。3.固相抗体竞争法 待测标本中抗原和Eu3+标记的抗原与固相抗体（特异性抗体包被固相）发生竞争结合，温育洗涤后在故乡中加入荧光增强液，测定荧光强度，所测得的荧光强度与待测抗原含量成反比。10.以检测淋巴细胞CD4抗原为例，说明免疫荧光显微技术直接法和间接法的检测原理。直接法：用荧光素标记（针对淋巴细胞CD4抗原的）特异性抗体，将该特异性荧光抗体直接滴加于待测标本上，直接与相应抗原反应。此法常用于细菌和病毒等病原微生物的快速检测、肾活检及皮肤活检的免疫病理检查。间接法：用荧光素标记抗淋巴细胞CD4抗体（抗抗体），待淋巴细胞CD4抗原与针对淋巴细胞CD4抗原的特异性抗体（第一抗体）反应，再用荧光素标记的抗抗体（第二抗体）结合第一抗体，通过荧光现象检查抗原或抗体。此法适用于检测各种自身抗体。11.以BA-ELISA为例说明生物素-亲和素系统的工作原理基本概念：BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素B与亲和素A间的高度放大作用,结合具有极高的亲和力，两者结合形成的复合物稳定性高及生物素和亲和素均可制成多种衍生物的特征而建立的一种检测系统。工作原理：将亲和素与标记酶（HRP）结合，一个亲和素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗或二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先于生物素化的抗体结合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。综上，即用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标记抗体，然后连接亲和素-酶结合物，从而使反应信号放大，又由于酶在遇到相应底物时的显示反应，达到检测未知抗原或抗体分子的目的。12.简述流式细胞术（FCM）的基本概念及其特点和临床医学应用与第5题相同
展开阅读全文