实验讲义2011生药.doc

实验一 抗生素生物效价测定【实验目的】1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。【实验原理】 抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.00.l mm，外径8.00.l mm，高100. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经1618小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。 （1）求出W和V： W=（SH+UH）-（SL+UL） (式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL） (式 2.10-2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出： =Dantilog（IV/W） (式 2.10-3)式中：供试品和标准品的效价比；D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。 （3）求出Pr ：Pr = Ar (式 2.10-4)式中：Pr：供试品实际单位数；Ar：供试品标示量或估计单位。【实验材料和仪器】1.实验材料（1）菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），菌液浓度约为106个/mL。菌株保存的时间过久，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。（2）抗生素标准品和供试品：头孢拉定标准品和供试品。（3）培养基：效价检定用培养基1号。（4）无菌缓冲液：称取磷酸氢二钾5.59g，磷酸二氢钾0.41g，加水1000mL，即为pH 7.8的磷酸盐缓冲液。制备缓冲液的试剂应为分析纯，配制后的缓冲液应澄清，分装于玻璃容器内，经121蒸气灭菌30 min备用。2. 实验仪器无菌室、培养皿（直径9 cm）、陶瓦盖、钢管、钢管放置器、恒温培养室、灭菌刻度吸管、玻璃容器、称量管、毛细滴管、天平、直尺或游标卡尺、超净工作台等。【实验步骤】1. 称量称量前，将抗生素标准品和供试品从冰箱取出，使与室温平衡，供试品应放于干燥器内至少30 min方可称取。供试品与标准品应用同一天平；吸湿性较强的抗生素在称量前12小时更换天平内干燥剂。标准品称量不可少于20 mg，取样后立即将称量瓶或适宜的容器及被称物盖好，以免吸水。 称样量的计算：W=V*C/P (式 2.10-4) 式中：W：需称取标准品或供试品的重量（mg） V：溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积量（mL） C：标准品或供试品高剂量的浓度（U/mL，g/mL） P：标准品的纯度或供试品的估计效价（U/mg，g/mg）2. 稀释从冰箱中取出的标准品溶液，必须先在室温放置，使其温度达到室温后，方可量取。标准品或供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释，取样量不得少于2 mL，稀释步骤一般不超过3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管23次，吸取样品溶液后，用滤纸将外壁多余液体擦去，从起始刻度开始放溶液。稀释标准品与供试品用的缓冲液应同一批和同瓶，（预计不够时，应事先与另一瓶混匀后再用），以免因pH或浓度不同影响预定结果。稀释时，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液体完全流下，再准确补加至刻度。标准品与供试品高低浓度之比为2:1或4:1，但所选用的浓度必须在剂量反应直线范围内。3. 双碟制备在超净工作台上，用灭菌大口吸管（20 mL），吸取已融化的培养基20 mL注入双碟内，作为培养基的底层，等凝固后更换干燥的陶瓦盖覆盖，放置2030 min，备用。取出试验用菌悬液，按已试验适当的菌量（高浓度所致的抑菌圈直径1822 mm），用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水浴中（一般细菌4850，芽孢可至60）的培养基内，摇匀作为菌层用。用灭菌大口5mL吸管，吸取菌层培养基5 mL，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上待凝固，用陶瓦盖覆盖，放置2030 min，备用。4. 放置钢管用钢管放置器，或其他方法将钢管一致、平稳地放入培养基上，钢管放妥后，应使双碟静置510 min，使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，再开始滴加抗生素溶液。5. 滴加抗生素溶液每批供试品取510个双碟，滴加溶液用毛细滴管或定量加样器，在滴加之前须用滴加液洗23次。在双碟的4个钢管中以对角线滴加标准品与供试品溶液的高、低二种浓度的溶液，滴加顺序为SHTHSLTL，也可用SLTLTHSH。（S代表标准品，T代表供试品，H代表高浓度，L代表低浓度），滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。滴加完毕，用陶瓦盖覆盖双碟，平稳置于双碟托盘内，双碟叠放不可超过3个，避免受热不均，影响抑菌圈大小，以水平位置平稳移入3537恒温培养室，培养至所需时间。6. 抑菌圈测量用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的直径，以毫米为单位，误差不超过0.1mm。【结果与计算】根据实验测量的抑菌圈大小，计算抗生素供试品的效价单位。【注意事项】 1. 玻璃仪器和其他器具需用专用洗液或其他清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，置150160干热灭菌2小时或高压121蒸气灭菌30分钟，备用。2. 实验中样品的称量、稀释、培养基倒平板等操作要严格的无菌操作。3. 制备平板时，放置培养皿的超净台的台面必须水平。可以将培养皿放在台面上，下垫一张白纸，皿内加水23 浅蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。4. 为保证双碟放置区域的平整，可在双碟底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。5. 在滴加抗生素到小钢管的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造成破圈。因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。此时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。换滴管重新滴加。6. 在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。7. 滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。8. 双碟在37下培养约16h。时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。9. 在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。应经常注意温度，防止意外过冷过热。10. 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。 【思考题】1. 为什么要用两步稀释，而不直接从1000U/mL稀释到10、20U/mL？2. 生物效价测定实验室被抗生素粉尘污染会导致什么后果？实验二 超滤膜分离技术【实验目的】1. 了解超滤膜分离的原理及方法2. 掌握超滤膜分离的基本操作方法3. 掌握采用超滤膜分离技术在蛋白、酶类分离纯化中的应用【实验原理】超滤技术是通过膜表面的微孔结构对物质进行选择性分离。当液体混合物在一定压力下流经膜表面时，小分子溶质透过膜（称为超滤液），而大分子物质则被截留，使原液中大分子浓度逐渐提高（称为浓缩液），从而实现大、小分子的分离、浓缩、净化的目的。超滤膜分离技术作为现代分离技术，因其具有设备简单、能在低温下操作、能耗小、生物活性物质不易失活、效率高等特点，近年来被广泛应用于生物活性物质的分离、浓缩和纯化。本实验以超滤膜分离浓缩-淀粉酶。【实验材料】1. 试剂(1) -淀粉酶液(2) 可溶性淀粉溶液(3) 磷酸缓冲液（pH6.0）(4) 碘液：碘11 g，碘化钾22 g，少量水溶解后，定容500 mL，作原液贮存棕色瓶。实验时，取2.0 mL，加碘化钾20 g，溶解定容至500 mL，贮于棕色瓶中。(5) 考马斯亮兰试剂：100mg考马斯亮兰G-250，溶于50 mL 95乙醇，加100 mL 85（W/V）磷酸，加水稀释到1000 mL，过滤贮存棕色瓶中(6) 标准蛋白溶液BSA（0.1 mg/mL）2. 仪器超滤器：截留分子量1万，膜面积50cm2；分光光度计，烧杯，试管，移液管等。【实验操作】1. 膜的清洗：在容器中加入200 mL去离子水，启动蠕动泵，直至去离子水全部滤过；将进液管、回流管和滤过管放入同一个盛有去离子水的容器中。启动蠕动泵，低速循环清洗30 min。2. 膜通量的测定：用烧杯接滤过液，同时用秒表计时，用滤过液体积除以相应时间和膜面积表示。3. -淀粉酶酶活及蛋白质（酶）含量测定(1) 酶活测定：吸取可溶性淀粉液5 mL于试管中，加入缓冲液1 mL，摇匀后，于60恒温水浴中预热5 min。再加入酶液1.0 mL（须作适当倍数稀释），立即计时，摇匀，准确反应5 min。立即吸取反应液1.0 mL于5 mL碘液中，摇匀，并以碘液作空白，于660 nm波长迅速测定其吸光度（A），根据吸光度查表，求得待测酶液的浓度。(2) 蛋白质含量测定：考马斯亮兰法。取1.0 mL待测液于试管中，加5 mL考马斯亮兰试剂，充分振荡混合（注意避免产生气泡，影响测定结果），2 min后于595 nm测定吸光值，参照标准曲线求得蛋白质含量。标准曲线：分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的BSA，以去离子水补足1.0 mL，按上述操作，各管测得的吸光值拟一标准曲线。4. 超滤：将120 mL淀粉酶液注入烧杯中，在蠕动泵带动下，溶液经进液管入超滤膜中，一方面溶液中的小分子物质经超滤膜渗透出来成超滤液从滤过管排出，另一方面溶液中的酶大分子物质得以保留并得到浓缩，从回流管返回到烧杯中。如此反复循环，直至达到规定的浓缩要求（浓缩45倍），同时记录超滤时间，求得酶的膜通量。5. 测得：分别测定浓缩液、滤过液的酶活及蛋白质含量，方法同步骤3。6. 膜的清洗：超滤结束，在容器中加入200 mL去离子水，启动蠕动泵，直至去离子水全部滤过；将进液管、回流管和滤过管放入同一个盛有250 mL 0.5mol/L NaOH的容器中。启动蠕动泵，低速循环清洗30 min。倒出清洗液，换成250 mL去离子水，继续清洗10 min。而后将滤过管单独放入一烧杯中，继续清洗至去离子水全部滤过，系统清洗完毕。【计算】根据原液、浓缩液、滤过液的酶活和蛋白质含量，以及超滤时间，按下列公式计算：(1) 膜通量滤过液体积/(膜面积时间)(2) 浓缩倍数原液体积/浓缩液体积(3) 截留率(1滤过液酶活/浓缩液酶活)100(4) 浓缩回收率(浓缩液体积浓缩液酶活)/(原液体积原液酶活)100【注意事项】1. 样品通过膜分离之前，一定要经过预处理，去除悬浮颗粒杂质，样品达到澄清状态，以防堵塞膜孔。2. 实验结束后，一定要对膜包进行彻底清洗，并加入防腐剂保存，以防微生物滋生破坏膜的结构。【思考题】1. 比较体积浓缩比、蛋白质浓缩比以及酶活浓缩比之间的差异，分析原因。2. 根据截留率、浓缩回收率，评价该超滤膜分离技术在酶分离浓缩方面的效果。吸光度与-淀粉酶浓度对照表吸光度(A)酶浓度(C)(/mL)吸光度(A)酶浓度(C)(/mL)吸光度(A)酶浓度(C)(/mL)0.1004.6940.3303.7790.5603.2090.1104.6440.3403.7500.5703.1900.1204.5940.3503.7210.5803.1710.1304.5440.3603.6930.5903.1530.1404.4920.3703.6650.6003.1350.1504.4420.3803.6370.6103.1180.1604.3940.3903.6100.6203.1010.1704.3470.4003.5830.6303.0840.1804.3010.4103.5540.6403.0680.1904.2570.4203.5280.6503.0520.2004.2140.4303.5020.6603.0370.2104.1720.4403.4770.6703.0220.2204.1320.4502.4520.6803.0080.2304.0930.4603.4270.6902.9940.2404.0560.4703.4040.7002.9810.2504.0190.4803.3800.7102.9680.2603.9840.4903.3570.7202.9560.2703.9510.5003.3350.7302.9440.2803.9190.5103.3130.7402.9320.2903.9000.5203.2910.7502.9210.3003.8690.5303.2700.7602.9110.3103.8390.5403.2490.7652.9060.3203.8090.5503.229实验三 固定化酶制备及酶活力测定【实验目的】1. 掌握包埋法固定化酶的操作技术。2. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。3. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法等。载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上(图1)。一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的连接的方法。在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。常用的载体包括天然高分子（纤维素、琼脂糖、葡萄糖凝胶、胶原及其衍生物），合成高分子（聚酰胺、聚丙烯酰胺、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等）和无机支持物（多孔玻璃、金属氧化物等）。共价结合法制备的固定化酶,酶和载体的连接键结合牢固,使用寿命长，但制备过程中酶直接参与化学反应，常常引起酶蛋白质的结构发生变化，导致酶活力的下降，往往需要严格控制操作条件才能获得活力较高的固定化酶。离子结合法通过离子效应将酶固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上的一种方法。能引起离子结合的载体,除具有离子交换基团的多糖类外,象离子交换树脂（见离子交换剂）那样的合成高分子衍生物也可用作载体。离子结合法与共价结合法比较,操作简便,处理条件温和，可以得到较多高活性的固定化酶。但载体和酶的结合力不够牢固，易受缓冲液种类和pH的影响。 物理吸附法将酶吸附到不溶于水的载体上而使酶固定化的方法。常使用的载体有活性炭、氧化铝、高岭土、硅胶、多孔玻璃、羟基磷灰石等。物理吸附法操作简便、费用较省,可供选择的载体类型多,有的可以再生。但酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶容易从载体上脱落，酶的非专一性吸附会引起酶的部分或全部失去。交联法：利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法（图2）。常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐共聚物等。参与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的-氨基、赖氨酸的-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。交联法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆弱。包埋法：将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化（图3）。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。将酶包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。【实验材料】1. 试剂（1） 海藻酸钠、3.0氯化钙；（2） 碱性蛋白酶：精确称取干酶粉1克，加入10 mL pH 10缓冲溶液，在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静止片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶解4次，最后全部移入100mL容量瓶中。用缓冲溶液定容至刻度，充分摇匀，用二层纱布或四层纱布过滤，吸取滤液10 mL，移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液为稀释1000倍的酶液（1.0 mg /mL）。（3） 福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO42H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO42H2O)、350mL蒸馏水、25 mL 85磷酸及50mL浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加25g硫酸锂、25 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500 mL。过滤，置于棕色瓶中暗处保存。使用前加4倍蒸馏水稀释。（4） 1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2 mol/L NaOH 4mL，充分研磨，用蒸馏水洗入100 mL容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100mL，保存于冰箱内。（5） pH 10缓冲溶液：甲液（0.05 mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O710H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000 mL。乙液：0.2 mol/L氢氧化钠溶液。配制pH 10硼砂氢氧化钠溶液：吸取甲液50 mL，再加入乙液21mL，用蒸馏水定容至200 mL。（6） 标准酪氨酸溶液：精确称取酪氨酸50mg，加入1mL 1mol/L盐酸溶解后用蒸馏水定容至50 mL，即得1 mg/mL酪氨酸标准溶液。（7） 0.4 mol/L碳酸钠溶液，0.4 mol/L三氯醋酸溶液。2. 仪器磁力搅拌器、恒温水浴锅、注射器、烧杯（100 mL，500 mL）、布式漏斗、分析天平、容量瓶、移液管、721分光光度计；【实验操作】1. 酶的固定化称取1.00 g海藻酸钠于盛有30 mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温渐冷却至38左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液20 mL。用注射器抽取海藻酸钠酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有200 mL 3.0氯化钙溶液的烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30 min，倾去氯化钙溶液，用适量蒸馏水洗涤2-3次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。2. 酶活力测定制备酪氨酸标准曲线(1) 取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。（见下表）(2) 在上述7支试管中，分别加入1%酪蛋白溶液1mL，于40水浴中保温15 min，取出后，加入0.4 mol/L三氯醋酸3 mL，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。(3)分别吸取滤液1mL放入另7支试管中，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL，福林试剂1mL，充分摇匀，于40水浴中保温15 min，然后于每管中各加入3 mL蒸馏水，充分摇匀。(4) 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm处测定光密度。(5) 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。试管编号酪氨酸含量（g ）1/mL酪氨酸标准溶液（mL）蒸馏水( mL )0123456010020030040050060000.10.20.30.40.50.62.01.91.81.71.61.51.4固定化酶活力测定上述固定化的蛋白酶或相当量的游离蛋白酶（20 mL）置于盛有20 mL pH 10缓冲液的三角瓶中，加20 mL 1%酪蛋白溶液，于40水浴保温15min后，取3 mL置于试管中，加3 mL三氯醋酸溶液。对照管为1 mL缓冲液1 mL蛋白酶液3 mL三氯醋酸溶液1 mL 1%酪蛋白溶液（顺序不可颠倒），于40水浴保温15min。摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液1mL，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试剂1 mL，充分摇匀，于40水浴保温15min，然后每管各加入3 mL蒸馏水，摇匀。用721型分光光度计在波长680 nm处，以对照管为对照，测定吸光值。【结果与计算】2. 本实验中碱性蛋白酶活力单位的定义：1克碱性蛋白酶粉在pH 10，40的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1微克酪氨酸，定为一个酶活力单位（U）。3. 本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算：每克碱性蛋白酶的活力单位 = m / t fm： 样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（g）；t： 酶促反应的时间（15 min）；f： 酶的稀释倍数，本实验中f = 1000；【注意事项】1. 酶液与加热溶解的海藻酸钠混合时，海藻酸钠溶液一定要冷却至40以下后再加入酶液，以免高温导致碱性蛋白酶酶失活。2. 固定化酶颗粒制备中，海藻酸钠酶混合物向CaCl2溶液滴加的速度不要过快，混合物要呈颗粒进入CaCl2溶液，以免形成念珠状颗粒。【思考题】1. 4种固定化酶方法各自的优缺点是什么？2. 酶活力测定过程中应注意哪些问题？实验四 香菇多糖提取、分离及单糖组成分析多糖是来自高等植物、动物细胞膜和微生物细胞壁的天然高分子化合物，是构成生命的四大基本物质之一。早期人们对于多糖的研究只注意到它作为能源物质的重要性和细胞的组成成分，近几十年来人们对多糖的生物活性才有了进一步认识，研究表明多糖具有一系列的生物活性，比如：抗肿瘤作用、抗病毒作用、降血糖作用、抗衰老、抗炎、抗凝血作用等。而且多糖是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞，提高机体免疫功能，具有一系列的生物活性。多糖的结构决定了其生物活性，多糖构效关系的研究已成为多糖研究的热点。但由于多糖结构的复杂性和多样性，其结构测定远远落后于蛋白质和核酸。多糖一级结构的分析包括：纯度鉴定，分子量测定，单糖组成测定和糖链的序列测定。糖链的序列测定包括：单糖残基在糖链中的次序，单糖残基间连键的位置，链的分支情况等诸多方面。本实验以天然多糖为材料，对多糖的研究作一初步示范。【实验目的】1. 掌握多糖提取的一般方法。2. 掌握多糖含量测定的基本原理。3. 掌握用离子交换色谱法分离多糖。4. 了解多糖一级结构分析的基本方法。一、多糖提取、分离【实验原理】一般来说，多糖溶于水或酸、碱、盐溶液而难溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂，因此可以用水提法提取多糖成分，然后用醇沉法析出多糖。多糖的分离纯化基本上可以用柱色谱完成，如离子交换色谱、吸附色谱以及凝胶色谱分别根据多糖不同的理化性质进行分离、纯化。不同多糖选择不同的分离手段，本实验将利用离子交换色谱分离香菇多糖。【实验材料】材料香菇粉末仪器与试剂旋转蒸发仪、离心机、水浴锅、50mL烧杯、250mL烧杯、15mL 试管、布氏漏斗、滤纸、100 mL量筒、长玻棒、95工业乙醇、色谱柱（3.0 cm35 cm）、DEAE纤维素（DE-52，纤维状）、蒸馏水【实验操作】香菇多糖的提取1. 称取香菇粉末10 g，于盛有500 mL蒸馏水的烧杯中，于9095水浴提取2 h，期间不时搅拌促使香菇多糖成分快速溶出。2. 提取液经布氏漏斗轻微抽滤，滤液体积V0用量筒测出，除保留5 mL用于提取多糖的含量测定外，其余置于烧杯中，加4 vol. 95工业乙醇，搅拌均匀后静置1 h可见絮状物析出，离心（3000 rpm，10 min）获沉淀，即得香菇多糖。香菇多糖的分离1. 色谱填料的活化处理（1）取DEAE纤维素10 g（一般按样品的质量的1520倍）悬于0.1N NaOH溶液中，浸泡过夜，用300 mL锥形瓶盛装；（2）次日，在布氏漏斗上轻吸过滤，用蒸馏水洗，直至pH 8.0左右，抽干；（3）用0.1N HCl浸泡30 min，用蒸馏水洗净，直至pH 6.0左右，抽干；（4）重新蒸馏水浸泡，倾去上层微细浮悬物，待用。2. 装柱：关闭柱的出口，向柱内加入1/3柱体积的蒸馏水，用玻棒引流将DEAE纤维素悬浮液倒入柱内，当交换剂在柱底部沉积时，打开流出口，让缓冲液缓慢流出，再倒入更多的悬液，直至整个用量加完为止。（注意：避免气泡产生）3. 上样：取醇沉的香菇多糖0.5g置于小烧杯中，溶于15ml的热水（5060）中。打开流出口，当柱面上的水完全进入柱内交换剂时，关闭活塞。用玻棒引流将溶解完全的样品沿柱内壁转一圈加入，打开活塞，当柱面上的样品溶液完全进入柱内交换剂时，关闭活塞。用胶头滴管取少量蒸馏水洗涤柱内壁残留样品，重复上述操作。4. 洗脱：在柱面上加蒸馏水，打开活塞，控制流速（2 mL/min），用11.5倍柱体积洗脱。同时每隔5 min换用试管收集流出液，依次做好标记，待测洗脱曲线。5. 收集：根据色谱图合并在洗脱峰范围的洗出液，旋转蒸发仪减压浓缩，当出现黏稠时，停止浓缩，浓缩液待用。二、多糖含量测定【实验原理】苯酚硫酸试剂与游离的或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在490 nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。【实验材料】仪器721型分光光度计。试剂(1) 98 的浓硫酸。(2) 80 苯酚：80g苯酚加20 mL水使之溶解，可置冰箱中避光长期贮存。 (3) 6 苯酚：临用前用80苯酚配制。(4) 标准葡萄糖溶液（0.1 mg/mL）：取100 mg葡萄糖，用蒸馏水溶解，定容至1 L。(5) 多糖样品：香菇多糖提取液。【实验操作】 1. 制作标准曲线：取9支干燥试管，按下表操作管号012345678标准溶液（mL）00.40.60.81.01.21.41.61.8蒸馏水（mL）2.01.61.41.21.00.80.60.40.26苯酚（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.0浓硫酸（mL）555555555静止10分钟，摇匀，室温放置20分钟A490横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线。2. 样品含量测定：取样品溶液，稀释适当倍数（如多糖提取液测定前应先稀释200倍）后，再取2.0 mL按上述步骤操作，测吸光值。3计算: 多糖得率(%)=(C V0 稀释倍数)/10100%C: 由标准曲线查得的多糖浓度V0：提取的滤液体积二、单糖组成分析【实验原理】多糖在浓硫酸中保温一定时间可完全水解为单糖，通过纸层析分离，特定试剂显色后与已知糖的标准混合物作对比，可以鉴定多糖水解产物中单糖的组成。【实验材料】器材离心机、水解管、加样器、1.5 mL离心管、滤纸、玻璃毛细管、层析缸、喷雾器。试剂 标准糖溶液: 称取一定量的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖，用蒸馏水溶解，得标准糖混合溶液(每种糖的点样量为20微克30微克)。 展层剂：正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：乙酸：吡啶：水=7：20：12：7：6：5；正丁醇：乙酸：水=4：l：5 (上层)。 显色剂：苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液(邻苯二甲酸1.6 g溶于水饱和的正丁醇100 mL，加苯胺0.93 g（相当于0.9 mL）。 BaCO3；1mol/L H2S04。【实验操作】l完全酸水解：取部分旋蒸获得的浓缩液50 L，加入1mol/L H2SO4 2mL；封管，110 水解5小时，然后加BaCO3中和，离心后取上清液作单糖分析。2薄层层析：在薄层板距一端2cm处画一横线作为点样线,在点样线上画两个点分别作为标准糖溶液和多糖水解液的点样位置。用玻璃毛细管点样，斑点尽可能小，而且每点一滴，待点样点干燥后，在同一位置再点第二滴。然后将滤纸条悬挂于层析缸中进行层析，展层时间约为5小时。3显色：将滤纸取出，自然干燥，喷上苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液，100条件下10分钟即可显色。标准单糖混合物色斑在滤纸上由下而上的顺序是：半乳糖-葡萄糖-甘露糖-阿拉伯糖。与标准单糖混合物色斑比较，即可判断多糖样品的单糖组成。【注意事项】1. 香菇粉末在水煮过程中，容易沉降在容器底部，造成受热不均匀，因此在没有自动机械搅拌的情况下，需手动间隔搅拌。2. 多糖的水解需完全，才能保证所含单糖的定性分析，因此水解时间必须充分。另外，点样时，尽量控制层析原点的大小。【思考题】1. 香菇多糖的用途，以及市场生产销售情况。2. 谈谈多糖结构分析所能用到的各种方法。