植物组织培养-新编讲义.doc

第一章绪 论目的要求：1掌握组织培养的概念和培养的类型2掌握组织培养的特点3一般掌握组织培养发展历史4初步掌握组织培养在农业实践上的应用第一节组织培养的意义高等植物的组织培养(tissue culture)技术是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。通常我们所说的广义的组织培养，是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。组织培养按培养对象可分为植株培养、器官培养、组织培养、细胞培养和原生质体培养等。 植株培养(plant culture)是对完整植株材料的培养，如幼苗及较大植株的培养。 2 器官培养(organ culture)即离体器官的培养，根据作物和需要的不同,可以分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养。 3. 组织或愈伤组织培养(tissue or callus culture)为狭义的组织培养，是对植物体的各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株。4. 细胞培养 (cell culture )是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养。 5. 原生质体培养(proplast culture ) 是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。 组织培养是本世纪发展起来的一门技术，由于科学技术的进步，尤其是外源激素的应用，使组织培养不仅从理论上为相关学科提出了可靠的实验证据，而且一跃成为一种大规模、批量工厂化生产种苗的新方法，并在生产上越来越得到广泛的应用。植物组织培养之所以发展如此快，应用的范围如此广泛，是由于其具备以下几个特点： 培养条件可以人为控制 组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化、以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。生长周期短，繁殖率高 植物组织培养由于可人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长快，往往个月左右为一个周期 。所以，虽然植物组织培养需一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化的高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。 第二节 植物组织培养的发展组织培养技术的蓬勃发展只是近50年的事，但它的整个历史可以追溯至19世纪末和上世纪初。20世纪初，在schleiden和schwann所发展起来的细胞学说的推动下，1902年德国植物学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织为许多细胞组成的观点，以及植物细胞全能性的理论，即植物的体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力。他首次发表了植物离体细胞培养实验的报告。1912年，Haberlandt的学生Kotte和美国的Robins在根尖培养中获得了组织培养的成功。Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。Robins用含无机盐、加葡萄糖或果糖的琼脂培养基，培养了长度为1.45-3.75厘米的豌豆、玉米和棉花的茎尖，形成了一些缺绿的茎和根。自Haberlandt的实验之后，直到1934年美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后28年间培养了1600代。 这之后，white又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气、pH、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基，其成份均为已知化合物，包括3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名为White培养基。与此同时，Gautheret(1934)在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义，并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起被誉为组织培养学科的奠基人。我们现在所用的培养方法和培养基，基本上都是由这三位科学家建立的。后来， White于1943年发表了植物组织培养手册专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。 四十年代Skoog和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素(IAA)对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。即这一比例高时，产生芽；这一比例低时，则形成根；相等则不分化。在寻找促进细胞分裂的物质过程中， Miller等人于1956年发现了激动素。不久即知道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加3万倍。结果上述控制器官分化的激素模式变为激动素与生长素的比例关系。这方面的成功发现，有力地推动了植物组织培养的发展。1952年，morel和Martin通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株。19351945年Muir 把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂，即实施了看护接种技术，使单细胞培养获得初步成功。1960年，cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。80年代中期以来，对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷，在这方面中国学者作出了重要贡献。1962年印度Guha等人成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，这促进了花药和花粉培养的研究。以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物获得成功，其数目达到160多种，其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引人注目的成就。1960年，motel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，其繁殖系数极高。由于这一方法有很大的应用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花工业。1973年Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体融合，获得了第一个体细胞杂种，Cocking等倡导的原生质体培养和体细胞杂交，研究得到了迅速发展，已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增殖分化生成杂种植株。在整个组织培养发展的历史中，我国学者做出多方面的贡献，除了前述的崔徵的工作以外，还有1993年李继侗等关于玉米等植物离体根尖培养的工作，以及罗士韦关于幼胚和茎尖培养，李正理关于离体胚培养、王伏雄等关于幼胚培养的工作。第三节 组织培养与农业的关系植物组织培养成为生物科学的一个广阔领域，除了在基础理论的研究上占有重要地位，在农业生产也得到越来越广泛的应用。一、快速繁殖优良种苗用组织培养的方法进行快速繁殖是生产上最有潜力的应用，包括花卉和观赏植物，其次是蔬菜、果树、大田作物及其它经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。快速繁殖可用下列手段进行：通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽；通过根、叶等器官直接诱导产生不定芽；通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。试管快速繁殖应用在下列研究中：1.繁殖杂交育种中得到的少量杂交种，以及保存自交系、不育系等。2.繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗。3.繁殖生产上急需的或种源较少的种苗。由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。组织培养突出的优点是“快”，通过这一方法在较短时期内迅速扩大植物的数量，以一个茎尖或一小块叶片为基数，经组织培养一年内可增殖到10,000100,000株。二、无病毒苗(Virus free)的培养 几乎所有植物都遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖，若蒙受病毒病，代代相传，越染越重。自从Morel(1952)发现采用微茎尖培养的方法可得到无病毒苗后，微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。若再与热处理相结合，则可提高脱毒培养的效果。对于木本植物，茎尖培养得到的植株难以发根生长，则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗。 组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用，如马铃薯，甘薯，草莓，苹果，香石竹，菊花等。已有不少地区建立了无病毒苗的生产中心，这对于无病毒苗的培养、鉴定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一个规范的系统程序，从而达到了保持园艺植物的优良种性和经济性状的目的。三、在育种上的应用植物组织培养技术为育种提供了许多手段和方法，使育种工作在新的条件下更有效的进行。如用花药培养单倍体植株；用原生质体进行体细胞杂交和基因转移；用子房、胚和胚珠完成胚的试管发育和试管受精等 ；种质资源的保存等等。 胚培养技术很早就有利用，在种属间远缘杂交的情况下，由于生理代谢等方面的原因，杂种胚常常停止发育，因此不能得到杂种植物，通过胚培养就可保证远缘杂交的顺利进行。到五十年代在实践上的应用就更多了，在桃、柑橘、菜豆、南瓜、百合、鸢尾等等许多园艺植物远缘杂交育种上都得到了应用。大白菜甘蓝的远缘杂交种“白兰”，就是通过杂种胚的培养而得到的。对早期发育幼胚因太小难培养的种类，还可采用胚珠和子房培养来获得成功，利用胚珠和子房培养也可进行试管受精，以克服柱头或花柱对受精的障碍，使花粉管直接进入胚珠而受精。花药、花粉的培养在苹果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘蓝、天竺葵等约20种园艺植物得到了单倍体植株。在常规育种中为得到纯系材料要经多代自交，而单倍体育种，经染色体加倍后可以迅速获得纯合的二倍体，大大缩短了育种的世代和年限。利用组织培养可以进行突变体的筛选。突变的产生因部位而异，茎尖遗传性比较稳定，根、茎、叶乃至愈伤组织和细胞的培养则变异率就较大。培养基的激素也会诱导变异，因浓度而不同。此外还有采用紫外线、X射线、射线对材料进行照射，来诱发突变的产生。在组织培养中产生多倍体、混倍体现象比较多，产生的变异为育种提供了材料，可以根据需要进行筛选。利用组织培养，采用与微生物筛选相似的技术，在细胞水平上进行突变体的筛选更加富有成效。原生质体培养和体细胞杂交技术的开发，在育种上展现了一幅崭新的前景。已有多种植物的经原生质体培养得到再生植物，有些植物得到体细胞杂种，这无论在理论和实践上都有重要价值。随着这方面工作的深入，水平的提高，原生质体培养一定会在育种上产生深远的影响。四、工厂化育苗 近年来，组培苗工厂化生产已作为一种新兴技术和生产手段，在园艺植物的生产领域蓬勃发展。 组培苗工厂化生产，是以植物组织培养为基础，在含有植物生长发育必需物质的人工合成培养基上，并附加一定量的生长调节物质，把脱离于完整植株的本来已经分化的植物器官或细胞，接种在不同的培养基上，在一定的温度、光照、湿度及pH、值条件下，利用细胞的全能性以及原有的遗传基础，促使细胞重新分裂、分化长成新的组织、器官或不定芽。最后长成和母株同样的小植物体。例如非洲紫罗兰组培苗的工厂化生产，就是取样品株一定部位的叶片为材料，消毒后切成一定大小的块，接种在适宜的培养基上，在培养室内培养，两个月左右在切口处产生不定芽，这些不定芽再切割后又形成新的不定芽，如此继续，即可获得批量的幼小植株，按需要量生产与样品株完全相同的苗子。工厂化生产组培苗，是按一定工艺流程规范化程序化生产的，具有繁殖速度快、整齐、一致、无虫少病、生长周期短、遗传性稳定的特点，可以加速产品的发展，尽快获得繁殖无性系。特别是对一些繁殖系数低、杂合的材料有性繁殖优良性状易分离、或从杂合的遗传群体中筛选出表现型优异的植株，需要保持其优良遗传性，有更重要的作用。组培苗的无毒生产，可减少病害传播，更符合国际植物检疫标准的要求，扩大产品的流通渠道，增加产品市场的销售能力，同时减少了气候条件对幼苗繁殖的影响，缓和了淡、旺季供需矛盾。世界上一些先进国家园艺植物组织培养技术的迅速发展从60年代就巳经开始，并随着生长、分化规律性探索逐步深化，到了70年代仅花卉业就已在兰花、百合、非洲菊、大岩桐、菊花、香石竹、矮牵牛等二十几种花卉幼苗生产上建立起大规模试管苗商品化生产，到1984年世界花卉幼苗产业的生产总值已达二十亿美元，其中美国花卉幼苗市场总值为六亿多美元，日本三友种苗公司有60的幼苗靠组织培养技术繁殖。1985年仅兰花一项，在美国注册的公司就有100余家，年销售额在一亿美元以上。由于组织培养技术的应用，加快了花卉新品种的推广。以前靠常规方法推广一个新品种要几年甚至十多年，而现在快的只要l2年就可在世界范围内达到普及和应用。我国采用快速繁殖技术，也使优良品种达到迅速的推广和应用。如广东切花菊“黄秀风”的应用，使菊花变大，长势加强，花色鲜艳，抗病力增强，打开了进入香港市场的渠道，使三十多种观叶植物的推广很快遍及全国，丰富了人们的生活；并将自然界的几百个野生金钱莲品种繁种驯化，培养了一批园林垂直绿化的材料，促进了园林业的发展。 植物组织培养也存有一定的困难，首先是繁殖效率与商品需要量的矛盾，有些作物由于繁殖方法尚未解决，因而无法满足生产的需要，其次是在培养过程中如何减少变异株的发生。更重要的是应降低组培苗工厂化生产的成本，只有降低成本，才能更好的投产应用。总之，随着组织培养这一技术的发展及各种培养方法的广泛应用，使这一技术在遗传育种、品种繁育等方面表现出了巨大的潜力，特别是生物工程和工厂化育苗实施以后，它将以新兴产业的面目在技术革命中发挥重大作用。本章小结1植物组织培养是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整植株的过程。2按照外植体的不同，植物组织培养可分为植株培养、胚胎培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。3组织培养具有：培养条件可以人为控制；生长周期短；繁殖率高；管理方便；利于工厂化生产的特点。因而发展迅速。4植物组织培养技术在农业生产上的应用主要体现在：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；植物育种；工厂化育苗等。复习思考题1植物组织培养的广义与狭义概念？2外植体的含义？3根据外植体的不同，植物组织培养可以分为几种？比较常用的是哪些？4植物组织培养有哪些特点？5你认为植物组织培养技术在目前的农业生产中有什么价值？为什么？第二章实验设备及培养条件目的要求：1掌握组织培养实验室的设计和组成及各组成部分的作用2掌握组织培养常用的实验仪器和设备及其使用方法3掌握调控组织培养的主要环境条件在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，太小则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格的无菌条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。第一节实验室一个标准的组织培养实验室应当包括洗涤室、配置室、无菌室、培养室、观察室等。在实际中可结合可行条件，合并一部分。一、洗涤室洗涤室完成玻璃器皿和其它仪器的清洗、干燥和贮存。室内应配备大型水槽，用于培养器皿的洗涤，最好是内衬白瓷砖的水泥槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺橡胶板，上下水道要畅通。备有大型塑料筐，用于放置培养器皿。可直接置于搁架上，以节约空间和便于运输工作。备有空干架，以空干涮净的培养器皿。二、配置室准备室要求明亮、通风。在准备室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。为完成培养基的制备工作，准备室还应配备以下仪器设备：1大型工作台 其高度应方便配制工作。2药品柜 用以放置常用药品。3普通冰箱 主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。4电子分析天平和托盘天平 电子分析天平精确度为0.001g，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品；托盘天平精确度为0.1g，用于称取用量较大的糖和琼脂等。天平应放置在干燥、不受振动的固定操作台上。5电蒸馏水器 电蒸馏水器， 采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母液或培养基，配培养基可用自来水来代替，若实验要求严格的话，则须用蒸馏水。6磁力搅拌器磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等 。磁力搅拌器还可加热 ，使之更利于溶解。7恒温水浴锅 水浴锅用于难溶药品的溶解、琼脂的溶化等。若没有水浴锅，也可用1500或2000W电炉或电饭锅代替。电炉应配有铝锅。8酸度计组织培养中培养基p值的准确度是十分重要的， 应当使用酸度计，若无酸度计，也可使用pH试纸进行粗测。首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。 测量p时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整p计上的温度扭使之和培养基温度相当。 注意保护好玻璃电极，用后电极应用蒸馏水冲洗净，盖上电极帽。9培养基分装设备 小型组织培养实验室可采用烧杯、漏斗等作为分装培养基的工具。也可采用医用“下口杯”作为分装工具，在“下口杯”的下口管上套一段软胶管，加一弹簧止水夹，使用时非常合用。更大规模或要求更高效率时，可考虑采用液体自动定量灌注设备。10高压灭菌锅 用以进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。如果是连续的大规模生产，应选用大型立式的或卧式的高压灭菌锅。通常以电作能源。11烘箱 用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持80100；进行干热灭菌需保持150，达小时；若测定干物重，则温度应控制在80烘干。 12恒温培养箱 内有温度调节器，生化培养箱还配有光源，用于植物材料的培养。三、接种室接种室是是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。在工作方便的前提下，无菌操作室宜小不宜大，一般78m2；要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光洁，易于清洁和消毒。无菌操作室应配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。无菌操作室要求干爽安静，清洁明亮，在适当位置吊装12盏紫外线灭菌灯，用以经常地照射灭菌。最好能安置一小型空调，使室温可控，这样可让门窗紧闭，减少与外界空气对流。无菌操作室应设有缓冲间，面积2 m2为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外灭菌灯，用以照射灭菌。 无菌操作室的主要设备及用具有：1接种箱在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。接种箱可参考图21自行仿制。现在也有许多厂家能够提供很漂亮的有机玻璃做的接种箱。 图21 接种箱构造图长700cm,上宽300cm，下宽450cm，高500cm。左右各有一个小拉门，背面下方有进气孔，顶上有出气孔。2 超净台超净台的优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开机10分钟即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。超净台功率在145260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大于0.3m的尘埃、细菌和真菌孢子等。超净空气的流速为每分钟2430m，这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。 3解剖镜 解剖镜种类较多， 用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。 双筒解剖镜在分离茎尖等较小组织时，便于观察、操作，通常放大倍。 放大倍以上操作需要有相当熟练的技术和较好的工具。为进行操作，要有照明装置。 解剖镜上要求带有照相装置， 根据需要随时对所需材料进行摄影记录。4无菌操作用的器具 按单人超净台上的用量计：酒精灯1个；2025cm长的医用镊子1把；4号解剖刀1把，解剖刀片若干；15cm医用剪1把；500ml广口瓶1只，内放酒精，用于浸泡镊子、刀、剪等；用于架放灼烧过的刀、镊子的小架。5搁架 贮放高压灭菌后等待接种的培养基。 四、培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要的培养架的大小、数目、及其它附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设层，最低一层离地高约100厘米，其它每层间隔30厘米左右，培养架即高1.7米左右。培养架长度，因一般在每层上端装置日光灯,以供照明，所以都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30 W的长米即可。宽度一般为60cm。培养室最重要的因子是温度， 一般保持在2027左右，可安装窗式或立式空调机。要求温度因热带植物和寒带植物等的种类不同而异，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在7080%为好,可安装加湿器。培养架上装置日光灯时，可安装定时开关钟控制照明时间，植物组织培养的光照强度一般在10004000勒克斯（lux）， 每天照明1016小时，也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为能源， 这样不但可以节省能源,而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天用灯光作补充。 第二节 设备和器材一、玻璃器皿在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。 要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成， 以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好， 能耐高压高温，能方便放入培养基和培养材料的器皿，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿.其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。最常使用的是三角瓶，规格有100、250、500毫升等， 一般使用100毫升三角瓶，无论静止或振荡培养皆适用。其培养面积大， 利于组织生长，受光也比试管好。由于瓶口较小，亦不易污染。培养皿常用9、12厘米直径等规格，要求上、下能密切吻合。这在游离细胞、 原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。试管常用口径18180 mm或20200mm规格。可用于培养较高的试管苗 ，另外也不易污染。培养器皿还可就地取材，采用一些代用品。工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶，加盖半透明的塑料盖，由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、 工作效率高，也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。目前，培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点，如培养容器多为平底方盒形，可增加培养的植株数，并能一层层地叠摞起来，从而节约空间。这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高温，可进行高压灭菌。有些产品为一次性消耗品，不但可节省洗涤人工，还可节省时间，提高效率。一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用时是非常方便的。瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。以前封口常用棉塞。不过这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基湿度。现在多采用聚丙烯塑料膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便， 且通气好。也可采用专用的封口材料如封口膜。在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，包括100、250、1000毫升烧杯；100、1000毫升量筒； 100、1000毫升试剂瓶（棕色）等等。二、器械用具镊子类主要采用医疗上用的镊子。根据操作的需要有各种类型，若用毫升的三角瓶作为培养瓶， 可用厘米长的镊子。镊子过短.容易使手接触瓶口， 造成污染。镊子太长，使用起来不灵活。某些微小部分的精细操作则用钟表镊子， 如在分离茎尖幼叶时，由于其尖端锋利，所以几乎可代替剪刀使用。剪刀类可采用五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。3解剖刀切割较小材料时可用解剖刀。 分离茎尖分生组织，有时也用解剖刀。 常用的解剖刀刀片可以经常调换，刀口要保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。解剖针解剖针用于深入到培养瓶中， 转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼叶。第三节 培养条件在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组培苗的生长和发育。一、温度温度是组织培养过程中的重要因素。 组织培养在最适温度下生长分化表现良好， 大多数组织培养都是在2327之间进行，很多研究者采用了25的恒温条件。低于15时培养，组织会表现生长停止，高于35时对生长不利。但是，不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20、月季是2527、番茄是28。 温度不仅影响组培苗的生长速度， 也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28为最好， 在12以下，33以上形成率皆最低。不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25下的高。 桃胚在25条件进行一定时间的低温处理， 有利于提高胚培养成活率。用35处理草莓的茎尖分生组织35天，可得到无病毒苗。二、光照 组织培养中光照也是重要的条件之一， 主要表现在光强、光质、以及光照时间方面：1光照强度 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响， 从目前的研究情况看，光照强度对外植体、细胞的最初分裂有明显的影响。 一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。2光质光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。 如百合珠芽在红光下培养，周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下， 几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。3光周期试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养， 最常用的周期是16小时的光照， 小时的黑暗，研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织， 在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养， 尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌桕树的愈伤组织。三、湿度湿度的影响包括培养容器和环境的湿度条件， 容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。 前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量， 否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基， 导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭度较高的封口材料易引起通透性受阻，也导致生长发育受影响。环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发， 一般要求的相对湿度， 常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高,进而影响组织培养的正常进行；过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。三、渗透压培养基中添加的盐类、 蔗糖、甘露醇及聚乙二醇类高分子化合物，影响到渗透压的变化。 个大气压对生长有促进作用，个大气压以上就对生长有阻碍作用， 个大气压生长就完全停止，个大气压细胞就不能生存。四、p值不同的植物对培养基最适p值的要求也是不同的（表2-），大多在.左右，一般培养基皆掌握在.，这基本能适应大多植物培养的需要。表2-不同植物的最适p值种 类最适PH值种 类最适PH值杜 鹃40月 季58越 桔45胡萝卜、石刁柏60蚕 豆55桃70番茄、葡萄57p值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样， 后者较高一些。一般来说当高于.时，培养基全变硬；低于时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低p值（约.个p） 因此在配制时常提高p值.单位。p值大小调整可用.的a和.的l来调整。ml的a可使p值升高.单位，ml的HCL可使值降低.单位。调节时一定要充分搅拌均匀。五、气体氧气是组织培养中必需的因素， 瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。 通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥， 夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。本章小结1植物组织培养实验室一般由洗涤室、配置室、接种室和培养室构成。其中，接种室是一个最为重要的操作室。2植物组织培养常用的设备和器材有：玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿等；器械用具，如镊子、剪刀、解剖刀、解剖针等；仪器设备，如超净工作台、冰箱、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、烘箱等。3温度、光照、氧气、PH、湿度都会影响到组织培养成功率，因此，实际培养外植体时，要根据不同的植物材料，将上述因素调整到适宜的范围。复习思考题1因地制宜建一个组织培养实验室，需要哪些组成部分？各部分的作用是什么？2常规组织培养时，需要什么设备和器械？你是否会用？3组织培养中，PH有什么作用？如果PH过高或过低会有什么后果？4谈谈组织培养中如何根据外植体的不同调整适宜的培养温度？第三章 培养基目的要求：1一般掌握培养基的种类、特点和各自的作用2掌握基本培养基的配方3一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量4掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤5熟练掌握培养基的分装和灭菌方法6一般掌握培养基的筛选办法培养基是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。在植物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。对植物的营养要求的不断认识，对已有培养基的改进，或者将新发现的植物激素、新的有益成分应用于培养基之中，都大大促进了组织培养研究的迅速发展，取得越来越多的成功。一、培养基的种类培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。培养基的产生最早是acks(1680)和nop(1681)，他们对绿色植物的成分进行了分析研究， 根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的acks和nop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。 以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基， hite培养基在四十年代用得较多，现在还常用。而到60和70年代则大多采用等高浓度培养基， 可以保证培养材料对营养的需要， 并能生长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入,也不致影响培养基的离子平衡。培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名， 如hite培养基，urashige和koog培养基（简称 培养基），也有对某些成分进行改良称作改良培养基。 目前国际上流行的培养基有几十种。常用的培养基及特点如下： 培养基 它是1962年由urashige和koog为培养烟草细胞而设计的。 特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适， 可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其它培养基为高， 广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。 5培养基 是1968年由amBorg等为培养大豆根细胞而设计的。 其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。 hite培养基 是1943年由hite为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作hite改良培养基，提高了g4 的浓度和增加了硼素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。 其特点是成分较简单，3和（4）24含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花药培养和其它组织培养。培养基 它是1974年为原生质体培养而设计的。 其特点是有机成分较复杂。它包括了所有的单糖和维生素。广泛用于原生质体和融合体的培养。常用培养配方如下：表 31 MS和White培养基配方表有机物(毫克/升)hite(毫克/升)433al224g42H24e42.a2-.n4 2.n2 8.6ol220.025u420.025.a2o42025H3BO3 6.2.烟酸(Vpp).盐酸吡多醇(VB6)0501盐酸硫胺素(VB1).肌醇 100甘氨酸23二、培养基的成分培养基的成分主要可以分水、 无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。水水是植物原生质体的组成成分， 也是一切代谢过程的介质和溶媒。 它是生命活动过程中不可缺少的物质。 配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成份的变化引起不良效果。无机元素大量元素，指浓度大于0.5mmol/l的元素，有、a、g、等。其作用是：(1)氮 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分， 是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以硝态氮和铵态氮两种形式供应。大多数培养基既含有硝态氮又含铵态氮。铵态氮对植物生长较为有利。 供应的氮化物有硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。(2)磷 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是、等的组成成分。在植物组织培养过程中， 向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对的吸收， 增加蛋白质在植物体中的积累。常用于培养基的磷化物有24或a24等。(3)钾 是植物营养、之一。对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。增加时，蛋白质合成增加， 维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为mg/l为好。制备培养基时，常以L、3 等盐类提供。 (4) g、和ag是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；是含蛋白质的组成成分。它们常以g472提供。用量为mg/l较为适宜； a 是构成细胞壁的一种成分，a对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以al22提供。(5)微量元素指小于0.5mmol/l的元素， e、n、u、o、o等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时， 它又是叶绿素形成的必要条件。 培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。 在制做培养基时不用e2（4）3和el3 （因其在pH.以上，易形成e（）3的不溶性沉淀），而用 e 42和 a2-结合成螯合物使用。、n、n、u、o、o等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，分裂异常。总之，植物必需营养元素可组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质。也可构成一些特殊的生理活性物质，如酶、辅酶以及作为酶的活化剂，参与活跃的新陈代谢。此外，还在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面起着重要作用。这些整株植物生长所必需的营养元素，对于植物组织培养来说也是必需的。当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；缺铁，细胞停止分裂；缺硫，表现出非常明显的褪绿；缺锰或钼，则影响细胞的伸长。有机化合物培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：(1)碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在，常用， 即配制升培养基称取克蔗糖，有时可用.，但在胚培养时采用的高浓度， 因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看:以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。 不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时一部分糖发生分解、制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。（2）维生素(Vitamin) 维生素类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多项代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上还明显不足，通常需加入一至数种维生素，以便获得最良好的生长。主要有VB1 （盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、VPP(烟酸)、VC(抗坏血酸) 、有时还使用生物素、叶酸、VB2等。一般用量为0.11.0mg/l。，有时用量较高。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，VPP与植物代谢和胚的发育有一定关系。VC有防止组织变褐的作用。(3)肌醇又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与6分子磷酸残基相结合形成植酸，植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸可进一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。使用浓度一般为毫克/升，在适当的情况下使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、 分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。(4)氨基酸是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其它的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时采用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约二十种氨基酸的混合物，用量在101000mg/l之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。（5）天然复合物其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用，特别是新的生长调节物质不断产生，更缩小了它的使用范围。可是由于其对一些难以生长培养材料的特殊作用，所以在一些试验中还常常应用它。 椰乳 是椰乳的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在，与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过毫米时，椰乳就不发生作用。香蕉 用量为毫升。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。马铃薯 去掉皮和芽后，加水煮3分钟，再经过过滤，取其滤液使用。用量为克/升。对pH缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。水解酪蛋白 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为毫克/升。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。其它 酵母提取液（）（.），主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液（.）、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。4.植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物激素是培养基的关键物质， 对植物组织培养起着决定性作用。（1）生长素类在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。 在极低的浓度下，（mg/L）就可促进生长。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。IAA（吲哚乙酸）是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低,是生长素中活力最弱的激素， 对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。NAA（萘乙酸）在组织培养中的起动能力要比IAA高出34倍，且由于可大批量人工合成， 耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进茎的增殖。IBA（吲哚丁酸）是促进发根能力较强的生长调节物质。2，4D（2，4二氯苯氧乙酸）起动能力比高倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高， 但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。生长素配制时可先用少量95酒精助溶。2，4D可用0.1mol/l的NaOH或KOH助溶。生长素常配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。 （2）赤霉素（GA）有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同、培养基中添加的是GA3，主要用于刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株，促进幼苗茎的伸长生长。此外，赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。赤霉素溶于酒精，配制时少量可用95酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70100失效，应当采用过滤灭菌法加入。（3）细胞分裂素类 这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA（6苄基氨基嘌呤）、Kt（激动素）、ZT（玉米素）等。其中ZT活性最强，但非常昂贵。常用的是6-BA。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的细胞类型，决定着愈伤组织再分化， 是长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度， 或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。生长调节物质的使用甚微，一般用mg/L（即ppm）表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度， 因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异,一般生长素浓度的使用为0.055mg/L， 细胞分裂素0.0510mg/L。5培养材料的支持物(1)琼脂 在固体培养时琼脂是最好的固化剂。固体培养基利于组织置于培养基表面。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90以上的热水。琼脂的用量在610g/l之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好，新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触（即吸收）面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是Ca、Mg及其它微量元素。因此在研究植物组织或细