家蚕核型多角体病毒lef-11与宿主相互作用项目申请书.doc

西南大学基本科研业务费专项资金项目计划任务书资助类别：学生项目 项目名称：家蚕核型多角体病毒lef-11与宿主相互作用研究申 请 者：董战旗单 位：家蚕基因组生物学国家重点实验室联系电话：18883252030起止年月：2015年 1 月 至 2015年 12月填报日期：2014年 9月 12 日西南大学科学技术处制2014.9基本信息申请者信息姓名董战旗性别男出生年月1989-12学位学士职称博士生研究领域家蚕病理学电话023-68250076手机18883252030Email18883252030163.com单位家蚕基因组生物学国家重点实验室项目基本信息项目名称家蚕核型多角体病毒lef-11与宿主相互作用用蛋白研究学科及代码昆虫病毒学 1805460国民行业代码0390科技活动 类型起止时间2015年1月 至2015年12 月申请金额 1 万元项目摘要项目研究意义(限100字) 家蚕是鳞翅目模式昆虫，由BmNPV引起的脓病是危害蚕桑产业的最大病害。先前对该病毒的研究主要集中于病毒基因组复制表达机制等方面，迫切需要解析BmNPV利用宿主增殖的分子机制，为脓病的有效防控提供支撑。主要研究内容(限200字)1、 LEF-11细胞定位研究通过免疫荧光技术鉴定家蚕核型多角体病毒LEF-11蛋白定位在细胞中的定位位置。2、 LEF-11蛋白免疫共沉淀研究通过过表达LEF-11,利用免疫共沉淀，通过质谱分析，筛选相互作用蛋白。3、 LEF-11相互作用蛋白鉴定。通过免疫荧光验证LEF-11与相互作用蛋白的共定位，同时通过免疫共沉淀验证相互作用蛋白。预期目标和成果AA. 以第一作者发表、我校为第一署名单位，被国际三大检索（SCI、EI和ISTP）系统收录的学术论文1篇、或A1类刊物论文1篇 关键词（最多5个，用分号隔开）家蚕； BmNPV； LEF-11；免疫共沉淀项目组主要成员编号姓名出生年月性别职称学位所在单位联系电话项目分工每年工作时间（月）签字1潘敏慧1969-08男教授博士家蚕基因组生物学国家重点实验室18523382171文章撰写102董战旗1989-12男博士生学士家蚕基因组生物学国家重点实验室18883252030质谱分析103胡楠1993-06男硕士生学士家蚕基因组生物学国家重点实验室18883243756免疫共沉淀104陈婷婷1991-09女硕士生学士家蚕基因组生物学国家重点实验室15826472203载体构建105678总人数高级中级初级博士后博士生硕士生4112项目经费预算 预算编制说明：在填报本表之前，请认真阅读本年度中央高校基本业务费专项申请的相关通知和文件的相关内容，各科目预算具体内容见西南大学科研经费管理规定。预算支出内容资金用途金额（万元）计算根据及理由设备费（不支持购买大型设备）0材料费测试化验加工费差旅费会议费（指西南大学主办）出版/文献/信息传播/知识产权事务费劳务费专家咨询费合 计报告正文一、立项依据与研究内容： 1、项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）1.1研究意义家蚕是重要的经济昆虫，家蚕核型多角体病毒（BmNPV）引起家蚕脓病，每年给蚕桑业造成巨大经济损失，目前尚无有效的治疗措施，其主要原因是病毒侵染宿主的作用机制不明确1。目前关于杆状病毒的研究主要集中于病毒基因功能的研究，对于杆状病毒与宿主相互作用机制研究较少，尤其是对杆状病毒利用宿主完成自身复制的研究。本课题通过研究lef-11基因与宿主相互作用蛋白研究，初步揭示BmNPV病毒侵染增值的分子机制，对进一步深化研究病毒宿主相互作用提空理论研究具有重要意义。1.2国内外研究现状及分析BmNPV是杆状病毒科的成员之一，能产生两种不同类型的病毒粒子一种包埋性病毒（ODV）和芽生型病毒（BV）2。由于其基因组只有130kb左右，编码150个氨基酸左右病毒通常需要通过与宿主之间的相互作用来帮助病毒完成复制等过程3。先前Rollie J. Clem课题组证实杆状病毒晚期表达因子LEF-7可以抑制宿主细胞H2AX蛋白磷酸化，劫持宿主细胞的DDR反应，最终调控病毒大规模复制4。同时在BmNPV中鉴定IE2同时与八个宿主蛋白相互作用，帮助病毒完成复制5。与其他病毒感染宿主一样，BmNPV感染宿主细胞后会通过与宿主细胞相互作用以破坏宿主细胞的防御体系，劫持宿主细胞进程以调控病毒自身的复制增殖。作为杆状病毒晚期表达因子（late expression factors，LEFs）家族是参与病毒DNA复制和病毒基因转录调控的一个十分重要的家族。其中，LEF-11是杆状病毒编码的一个13KDa的小分子蛋白6。先前对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）的lef-11研究表明，其对病毒DNA复制、病毒基因的转录和病毒的增殖都有影响7。我们小组先前对LEF-11核定位进行研究表明其定位于宿主细胞复制中心，说明LEF-11很有可能参与病毒感染宿主细胞后的DNA复制8。同时我们过表达lef-11基因鉴定其定位与DNA复制中心。鉴于此，本项目拟以鉴定家蚕核型多角体病毒LEF-11蛋白与宿主相互作用蛋白为研究对象，采用生物信息学和分子生物学等手段，鉴定LEF-11核定位，通过免疫共沉淀技术筛选并鉴定与LEF-11相互作用蛋白，最用验证与LEF-11相互作用的宿主蛋白。通过该研究可完善BmNPV侵染增殖的分子机制，为抗病育种奠定基础。参考文献：1.Blissard, G.W., Baculovirus-insect cell interactions. Cytotechnology, 1996. 20(1-3): p. 73-93.2.Hefferon, K.L., Baculovirus late expression factors. J Mol Microbiol Biotechnol, 2004. 7(3): p. 89-101.3.Gomi, S., K. Majima, and S. Maeda, Sequence analysis of the genome of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus. J Gen Virol, 1999. 80 ( Pt 5): p. 1323-37.4.Mitchell, J.K., N.M. Byers, and P.D. Friesen, Baculovirus F-box protein LEF-7 modifies the host DNA damage response to enhance virus multiplication. J Virol, 2013. 87(23): p. 12592-9.5.Wu, Y., et al., Screening of candidate proteins interacting with IE-2 of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus. Mol Biol Rep, 2013. 40(10): p. 5797-804.6.Lin, G., J.M. Slack, and G.W. Blissard, Expression and localization of LEF-11 in Autographa californica nucleopolyhedrovirus-infected Sf9 cells. J Gen Virol, 2001. 82(Pt 9): p. 2289-94.7.Lin, G. and G.W. Blissard, Analysis of an Autographa californica nucleopolyhedrovirus lef-11 knockout: LEF-11 is essential for viral DNA replication. J Virol, 2002. 76(6): p. 2770-9.8.Zhang, J., et al., Inhibition of BmNPV replication in silkworm cells using inducible and regulated artificial microRNA precursors targeting the essential viral gene lef-11. Antiviral Res, 2014. 104: p. 143-52.2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。2.1研究内容1）LEF-11核细胞定位研究通过免疫荧光技术鉴定家蚕核型多角体病毒LEF-11蛋白定位在细胞核内，利用BrdU标记技术确定其定位于宿主细胞DNA复制中心。2）LEF-11免疫共沉淀研究通过过表达LEF-11,利用免疫共沉淀和质谱分析技术，分析过表达后对宿主蛋白表达的影响。3）LEF-11相互作用蛋白研究通过免疫荧光共定位LEF-11与筛选的宿主蛋白并通过免疫共沉淀等试验技术鉴定与LEF-11相互作用蛋白。2.2研究目标1）鉴定LEF-11核定位，分析其定位位置。2）揭示LEF-11过表达对宿主细胞蛋白表达的影响。3）通过筛选与LEF-11相互作用蛋白，鉴定LEF-11与宿主相互用蛋白。2.3拟解决的关键问题鉴定lef-11基因与宿主细胞相互作用蛋白。3、拟采取的研究方案及可行性分析。1）BmNPV LEF-11蛋白核定位信号鉴定利用LEF-11抗体免疫荧光分析LEF-11蛋白亚细胞定位，同时借助BrdU抗体对LEF-11在细胞核内进行精细定位；（该部分研究内容已完成）2）BmNPV LEF-11蛋白过表达对宿主细胞蛋白表达影响利用LEF-11蛋白过表达后，以LEF-11为诱饵蛋白，通过检测蛋白条带变化鉴定宿主细胞蛋白表达量差异的变化。通过质谱分析筛选与LEF-11相互作用的宿主蛋白。3）lef-11基因相互作用蛋白研究通过免疫荧光和免疫共沉淀技术，验证与LEF-11共定位的宿主蛋白及相互作用的蛋白。（2）技术路线本项目的技术路线如下图。(3)关键技术1) 免疫共沉淀技术。它决定了是否可以找到LEF-11互作的宿主蛋白，是研究lef-11基因对宿主细胞调控的前提条件；2) 稳定高效的家蚕基因过表达技术。它决定了目标基因过表达的效率，是基因功能研究的控制性因素。项目承担单位已经建立了以上关键技术的技术平台，并能熟练运用以上技术。同时，以上关键技术所涉及的仪器本单位都能提供和满足。（4）可行性分析1）在前期研究中，我们已经建立了高效蛋白相互作用研究平台。（相关数据已经发表在病毒学权威杂志Virus Research上）。同时，我们对LEF-11核定位机制的研究也为此项目继续深入鉴定基础（相关数据已经发表在病毒学权威杂志Virus Research上）。本项目选题既有理论意义，又有应用价值，研究方案切实可行，技术路线合理，所用实验技术方法先进，能够按期完成预定研究任务。2）本项目承担单位为“家蚕基因组学国家重点实验室”，本实验室完成了家蚕全基因组测序和家蚕EST数据库构建，可为项目的实施提供了信息的支撑；本研究室有强大的基因组信息分析平台、家蚕细胞系平台、蛋白质组分析技术和病毒基因敲除等关键技术的技术平台，可为本项目的实施提供了技术保证。无论从前期研究基础、研究内容、研究方案和技术路线、团队成员组成和研究条件方面，都为本项目的实现提供了保证。因此，本研究方案是切实可行的。4、本项目的特色与创新之处。（1）项目特色1）本项目将病毒基因的研究并未局限于对病毒自身的调控功能研究上，而拓展到病毒与宿主互作研究，因此在研究内容上具有特色；3）本项目把生物信息学、分子生物学和病毒学新理论和先进方法结合在一起，利用免疫共沉淀、和过表达等先进技术，并充分利用交叉学科的优势，将其综合运用在LEF-11与宿主相互作用的研究中。因此，研究方法具有特色。（2）项目创新之处通过项目实施，可鉴定家蚕核型多角体病毒lef-11基因对宿主蛋白相互作用的蛋白，丰富和完善病毒-宿主互作的理论基础。因此，研究的理论和应用价值上具有创新性。5、年度研究计划、预期研究结果及成果提供形式。研究内容年度及进展计划预期结果1-3月4-6月7-9月10-12月研究内容一： LEF-11蛋白核定位研究1）核定位鉴定鉴定出核定位位置研究内容二： lef-11影响宿主蛋白表达 1）过表达分析确定高效表达目的基因3）银染分析确认LEF-11影响宿主蛋白表达研究内容三： lef-11基因与宿主相互作用蛋白研究1）质谱分析筛选出与宿主细胞相互作用蛋白2）免疫共沉淀鉴定出BmN-SWU1宿主细胞中与LEF-11蛋白相互作用的蛋白（2）预期研究结果1）确定LEF-11蛋白核定位位置；2）鉴定宿主细胞中与LEF-11相互作用蛋白。3）在国内外重要刊物上发表论文12篇；二、研究基础与工作条件1、工作基础与条件（1）、工作基础 本项目申请是建立在申请人从事家蚕病理学研究基础上的，申请人已获得与本项目相关的研究积累如下：1) LEF-11蛋白的亚细胞精细定位为了分析LEF-11在病毒感染宿主细胞后的功能，通过共聚焦荧光显微镜分析了LEF-11亚细胞精细定位。结果显示：感染后12 h，在细胞核内可以检测到LEF-11以聚集的形式存在。为了精确标记LEF-11所在的核内区域，我们利用-LEF11和-BrdU双荧光标记了宿主DNA复制位点，结果表明：LEF-11在细胞质中表达后迅速的转运到病毒DNA复制中心。结合LEF-11表达时相，我们推测LEF-11不直接参与病毒DNA复制起始，可能调控基因组复制起始后的扩大（图1）。这些研究结果为解析LEF-11蛋白对宿主复制增殖的调控作用奠定了基础。图1 LEF-11的亚细胞定位2)LEF-11过表达后为了分析LEF-11过表达后，分析LEF-11表达量，通过Western blot分析了LEF-11过表达后，LEF-11蛋白表达效率。为了精确验证LEF-11过表达后宿主蛋白变化，我们利用-LEF11抗体标记了LEF-11蛋白表达量，结果表明：LEF-11过表达后，宿主细胞高效表达了目的蛋白，为进一步分析鉴定了基础（图2）。这些研究结果为进一步分析LEF-11蛋白过表达后宿主蛋白变化奠定了基础。图2 LEF-11过表达效率分析（2）、工作条件本项目将依托“家蚕基因组生物学国家重点实验室”完成。本研究室是我国蚕学学科唯一的国家重点实验室，并有特种经济动物饲养全国重点学科为支持。实验室拥有10000M2的专用实验室和4000M2的养蚕设施。拥有核酸分析、蛋白质分离纯化、细胞培养与染色体研究、转基因动物、微生物和生物信息分析的专用实验室，拥有遗传分析仪、飞行时间质谱仪、蛋白质双向电泳系统、显微注射仪、Dige Enabled Typhoon、流式细胞仪、SNP分析仪和激光共聚焦显微镜等各类仪器设备3100余台/套，设备总价值4000万元。这些高通量、高效率和高起点的功能基因研究平台，能满足本项目研究的需要。2、申请人简介1董战旗 1）个人简介（应包含本项目中承担的任务）董战旗，西南大学，家蚕基因组生物学国家重点实验室，博士生，本项负责人。从事家蚕病理学研究。参与国家自然基金项目，发表论文5篇，其中以第一作者发表于病毒学权威杂志Virus Research上一篇。2）受教育经历 2014/09，西南大学，家蚕基因组生物学国家重点实验室，博士 2012/092014/06，西南大学，家蚕基因组生物学国家重点实验室，硕士 2008/092012/06，太原师范大学，生命科学系，学士3）科研成果1 Dong ZQ, Zhang J, Chen XM, He Q, Cao MY, Wang L ,Li HQ, Dong XL, Pan CX, Lu C.*,Pan MH*. Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ORF79 is a per os infectivity factor associated with the PIFs complex. Virus Research. http:/dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2014.02.009.2 Zhang J, Dong ZQ, He Q, Chen CM, Cao MY, Li HQ, Xiao WF, Lu C.*, Pan MH*. Identification of a novel nuclear localization signal of baculovirus late expression factor 11. Virus Research http:/dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2014.02.020.3 Zhang J, He Q, Zhang CD, Chen XY, Chen XM, Dong ZQ, Li N, Kuang XX, Cao MY, Lu C.*, Pan MH*. Inhibition of BmNPV replication in silkworm cells using inducible and regulated artificial microRNA precursors targeting the essential viral gene lef-11. Antiviral Res. 104 (2014) 143152.4 董战旗，张军，鲁成，潘敏慧* .家蚕核型多角体病毒ie1基因多克隆抗体制备及功能初探. 西南大学学报. 2014.10三、经费预算说明四、申请者承诺 我保证申请书内容的真实性。如果获得专项资金资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守有关规定，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。签字： 日期： 五、导师推荐意见(请学生导师填写意见，并承担监督本项目执行的责任) 导师（签字）： 日期：六、学院（所、中心）审查意见 已按有关规定和申报通知要求对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对研究实施所需的人力、物力和工作时间等条件给予保障，督促项目负责人认真开展研究工作，及时报送有关材料。 负责人（签字）： 单位公章 日期：七、学校领导小组意见建议资助金额 万元 建议立项意见 年 月 日