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编号南方医科大学研究生开题论证报告书学科专业：护理学研究方向：医院感染控制课题名称：内镜生物膜现状调研及手工刷洗效果的研究课题来源：自选研究生姓名：导师姓名职务：研究时间：2010年10月1日起2011年12月1日止论证日期：2010年12月9日说 明一、研究生作开题论证报告，是审核课题是否符合科学性、可行性的要求及学位论文进度计划，保证学位论文质量的有力措施，也是对研究生阶段考核。研究生在正式开题前都必须认真作好开题论证报告。二、研究生作开题论证报告，一般要邀请与本课题研究内容关系密切的相关学科专家教授35名及所在学院（研究所或医院）主管部门领导参加。报告会由本科室主任或指导教师主持。三、经严格论证，对于选题合适，方法得当的可批准开题，对于尚有不足，必须按要求修改补充，必要时重新作论证报告。四、开题论证报告书中各项内容，都要实事求是，逐条认真填写。表达要准确。措词要简练，字迹要清楚易辨。五、封面上“课题来源”指：国家自然科学基金、军队医药卫生科研基金、广东省自然科学基金、校长科学基金和自选等。六、本报告填写一式三份。交学校研究生学院培养科、所在的二级学院（研究所或医院）业务主管部门及科室各一份。一、课题名称（包括分题）内镜生物膜现状调研及手工刷洗效果的研究二、选题依据（国内外研究概况、水平和发展趋势，开展此课题研究的设想、特色或创新之处，主要参考文献目录和出处）(一) 国内外研究概况、水平和发展趋势随着内镜技术近20年来的飞速发展，通过内镜技术对相关系统疾病进行检查及治疗已广泛应用于临床。由于内镜属于重复使用的医疗器械，国家2004年颁布的内镜清洗消毒技术操作规范 中华人民共和国卫生部内镜清洗消毒技术操作规范S卫医发2004100号2004：5-9要求使用后的内镜必须按照要求经过高水平消毒合格后方能用于其它患者。高水平消毒主要分为清洗（水洗和清洗剂浸泡）和消毒两大步骤：水洗是通过手工刷洗的方法对内镜进行初步的清洁，清洗剂浸泡是通过清洗剂的灌流清除内镜生物负荷，高水平消毒是使用消毒剂进行灌流处理使之达到高水平消毒的效果。但由于临床内镜使用的高周转率、内镜本身结构精密度高、结构复杂、材质特殊，多数不耐高温、易腐蚀，使用后微生物和有机物残留，给使用后内镜的清洗、消毒带来困难，容易形成生物膜（Biofilm）。生物膜是微生物通过嵌入自身分泌的胞外多聚体物质（Extracellular Polymeric Substances，EPS)而形成的不可逆的、紧密结合的结构群体，附着在有或无生命物体表面，并且表现为生长速率、基因转录和表型的改变。 J.W. Costerton, P.S. Stewart, E.P. Greenberg. Bacterial Biofilms: A Common Cause Of Persistent Infections. Science 1999:284:13181322. Rodney M. Donlan and J. William Costerton. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews 2002:15:167193. D. Lindsay, A. von Holy. Bacterial biofilms within the clinical setting: what healthcare professionals should know. Journal of Hospital Infection 2006:64:313-325.由于生物膜对外界环境的抵抗力强，影响清洗消毒的效果，是造成消毒失败和患者感染的重要原因。国内外的医学专家、研究学者对生物膜进行了大量的实验研究，现将与内镜生物膜清除相关的国内外研究概况叙述如下:国外研究概况：1. 内镜生物膜相关感染日益受到重视，但缺乏统一明确的内镜清洗规范。近年来，各国纷纷出台内镜清洗消毒及感染控制的临床指南和规范 ESGE Guidenlines Committee. Technical note on Cleaning and Disinfection. Acta Endoscopica 2003:33:639-650 J.C. Darbord. Importance of cleaning for reprocessing endoscopes and thermolabile sterile medical devices: French use and regulations. Journal of Hospital Infection 2004:56:S40S43. U. Heudorf, M. Exner. German guidelines for reprocessing endoscopes and endoscopic accessories: guideline compliance in Frankfurt/Main, Germany. Journal of Hospital Infection 2006:64:69-75. Tandon RK, Ahuja V. Non-United States guidelines for endoscope reprocessing. Gastrointest Endosc Clin N Am 2000;10:295-318. Alvarado CJ, Reichelderfer M. APIC guidelines for infection prevention and control in flexible endoscopes. Am J Infect Control 2000;28:138-155. 10 11 12,社会、公众对于内镜清洗消毒失败的关注，也增加了临床内镜机构对于规范的遵从性、重视度 Douglas B. Nelson. Recent advances in epidemiology and prevention of gastrointestinal related infections. Current Opinions in Infectious Diseases 2005:18:326-330.。但是规范和指南对手工刷洗和清洗剂浸泡等具体步骤未能有明确的说明。法国健康产品安全署 (The French Agency for Safety of Health Products, AFSSAPS)颁布的规范6中仅规定了刷洗的时间不能少于10min。美国消化护士学会(the Society of Gastroenterology Nurses and Associates, Inc. SGNA)2010年最新颁布的标准中只规定了使用合适规格的清洗刷对内镜管道进行刷洗直至没有肉眼可见的污物。 Standards of infection control in reprocessing of flexible gastrointestinal endoscopes. Gastroenterology Nursing 2010:33:70-80.美国食品与药物管理局(the U.S. Food and Drug Administration, FDA, U.S.)关于内镜自动清洗机的指南中却提到，某公司生产的自动清洗机在机洗步骤之前只需进行床边预处理，无需进行手工刷洗步骤。 The American Society for Gastrointestinal Endoscopy (ASGE). Automated endoscope reprocessors. Gastrointestinal Endoscopy 2010:72:675-680.FRANK M. MOSES和JENNIFER S. LEE对美国内镜机构的调查发现实行手工刷洗和清洗剂清洗的占70%；存在重复使用一次性内镜清洗刷的占66%；对钳子管道刷洗一次、二次、三五次、五次的比例分别为21%、35%、37%、4%。 FRANK M. MOSES, MD, and JENNIFER S. LEE, RN. Current GI Endoscope Disinfection and QA Practices. Digestive Diseases and Sciences, Vol. 49, Nos. 11/12 (November/December 2004), pp. 17911797.究其原因，都是由于规范未阐述手工刷洗过程中清洗刷的选择，刷洗的次数、时间、速度等重要步骤，说明较为模糊，导致各内镜机构手工刷洗方法的巨大差异性，清洗效果也无法得到保证。2. 手工刷洗的作用对于预防生物膜形成及其清除的相关研究尚缺乏。手工刷洗能够有效的清除内镜管道污染物已经被证实，Timothy S Charlton使用4种不同类型的清洗刷对内镜管道进行刷洗实验，结果显示刷洗步骤能够清除新的内镜管道中52%96%的污染物和旧的内镜管道中73%85%的污染物，不同的清洗刷对污染物的清除效果也不相同。 Timothy S Charlton. A comparison of the efficacy of lumen-cleaning devices for flexible gastrointestinal endoscopes. Australian Infection Control 2007:12:81-90.但是不同结构、不同型号的清洗刷对于内镜管道的手工刷洗效果尚未被比较与证实。由于生物膜都是牢固附着在内镜管道壁上，且更易于附着在损伤的管道部位，使得清除生物膜的难度大大增加。注气注水管道由于结构及管道细小无法进行机械清洗，而只能通过清洗剂和消毒剂的灌注达到清洗消毒作用，因此较钳子管道更容易形成生物膜，这在A. Pajkos等17对内镜管道进行的检测中也被证实。由此可见，有无实施手工刷洗对生物膜的清除是有其实际意义的。对于手工刷洗作用的研究，为内镜管道生物膜的预防和清除带来比清洗剂和消毒剂效果更佳的可能。3. 内镜生物膜的存在经小样本实验检测证实，但无现状调研及相关因素分析。Tom Coenye等 Tom Coenye, Hans J. Nelis. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of Microbiological Methods 2010:83:89105.的研究估计人类感染的65-80%是与生物膜相关的。Linda Bisset等 Linda Bisset, Yvonne E. Cossart, Warwick Selby, Richard West, Denise Catterson, Kate OHara, Karen Vickery. A prospective study of the efficacy of routine decontamination for gastrointestinal endoscopes and the risk factors for failure. Am J Infect Control 2006:34:274-80.对高水平消毒后且细菌培养为阴性的109条内镜进行PCR检测，发现有40%的内镜钳子管道有大肠杆菌DNA残留，提示这些内镜可能有生物膜的形成。同样在A. Pajkos等 A. Pajkos, K. Vickery, Y. Cossart. Is biofilm accumulation on endoscope tubing a contributor to the failure of cleaning and decontamination? Journal of Hospital Infection 2004:58:224229.对正在临床使用的13条内镜管道的检测中发现，有5条的活检吸引管道和12条注气注水管道形成了生物膜，其中9条尤为严重。内镜管腔表面的光滑程度与否对于污染物的黏附残留非常重要，如果管腔等的表面有纵向划痕，会导致球菌的积聚。 K. A. WHITEHEAD, J. VERRAN. The effect of surface topography on the retention of microorganisms. Food and Bioproducts Processing 2006:84(C4): 253259.对内镜生物膜使用临床调研的方法，开展调查问卷与实验室检测，了解生物膜的形成与内镜临床使用、清洗消毒间关系的有关研究尚缺乏。4. 执行严格而有效的清洗流程是预防内镜生物膜形成的重要条件。生物膜在内镜管道中的形成不乏报道，Linda Bisset16和A. Pajkos17的实验报道中内镜生物膜的发生率分别为40%和92%。有学者认为，通过清洗步骤就能够降低细菌生物膜在内镜管道中形成的机率。 American Society for Gastrointestinal Endoscopy (ASGE). Infection control during GI endoscopy. Gastrointestinal Endoscopy 2008:67:781-790. K. Marion, J. Freney, G. James, E. Bergeron, F.N.R. Renaud, J.W. Costerton. Using an efficient biofilm detaching agent: an essential step for the improvement of endoscope reprocessing protocols. Journal of Hospital Infection 2006:64:136-142.欧洲消化内镜协会(European Society for Gynaecological Endoscopy, ESGE)颁布的清洁和消毒技术说明（2003）5指出，清洗是整个内镜清洗消毒流程中最为关键的步骤。如果手工刷洗的步骤没有有效的实施，残留在内镜管道中的蛋白质由于消毒剂得固定作用而促进生物膜形成，残留在管道内的有机物会影响消毒剂的消毒作用而最终导致消毒的失败 G. Kampf, R. Blo, H. Martiny. Surface fixation of dried blood by glutaraldehyde and peracetic acid. Journal of Hospital Infection 2004:57:139143.。不彻底的清洗与消毒间互为因果、恶性循环，导致生物膜的形成而引发内镜相关感染的发生。一旦生物膜在内镜管道中形成，仅使用常规的清洗消毒方法是无法将其有效去除的。17因此，有效的消毒必须以合格的清洗为前提，这对于预防内镜生物膜的形成具有重要意义。内镜管道内成熟生物膜的强抵抗性会导致常规清洗和消毒的无效，引发一系列的医院感染问题。5. 有效的清洗对生物膜的清除作用受到普遍重视。对于生物膜的清除，美国APIC（The Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology, Inc）指南9指出，能够减少生物膜的形成和活性对于减少内镜相关感染尤为重要，并强调彻底手工刷洗对此的重要性。Karine Marion等 Marion K, Pasmore M, Freney J, et al. A new procedure allowing the complete removal and prevention of hemodialysis biofilms. Blood Purif 2005;23:339-348. 的血液透析装置生物膜沾染实验表明，与消毒剂比较，生物膜的清除应该更重视清洗的作用。Jaeeun Kim等 Jaeeun Kim, Betsey Pitts, Philip S. Stewart, Anne Camper, and Jeyong Yoon. Comparison of the Antimicrobial Effects of Chlorine, Silver Ion, and Tobramycin on Biofilm. Antimicrobial Agents And Chemotherapy 2008:52:14461453.的研究表明，生物膜中的大肠杆菌对含氯消毒剂的敏感性比浮游的大肠杆菌下降了8300倍。对于成熟的生物膜，使用含有季胺类化合物的消毒剂不仅不能去除生物膜，反而将生物膜固定于内镜表面，导致其更不易于被清除。20Karen Vickery等 Vickery K, Pajkos A, Cossart Y, et al. Removal of biofilm from endoscopes: evaluation of detergent efficiency. Am J Infect Control 2004;32:170-176.的实验研究表明，不同的清洗剂能够清除内镜管道上065%的生物膜，其中不含酶的清洗剂Matrix能够完全清除生物膜中的细菌和EPS。由此可见，内镜清洗消毒的两大步骤中，清洗对成熟生物膜的清除作用是更为主要的。6. 生物膜形成机制的基础研究较为丰富，但是未能为预防生物膜及其清除形成提供依据。生物膜最初由自由游动的细菌黏附在内镜管道表面，细胞与细胞间形成柱状和蘑菇状的信号交流结构，液体能够在周围循环。该结构使细菌最大程度的暴露在流动的营养下，而且减少了细胞废弃物的堆积。对于这些形成机制的研究，国外有细菌黏附机制 K.C. Marshall, R. Stout, R. Mitchell. Mechanism of the initial events in the sorption of marine bacteria to surfaces. J. Gen. Microbiol. 1971:68:337348. Katsutoshi Hori, Shinya Matsumoto. Bacterial adhesion: From mechanism to control. Biochemical Engineering Journal 48 (2010) 424434.、微菌落结构机制 A. Bridier, F. Dubois-Brissonnet, A. Boubetra, V. Thomas, R. Briandet. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. Journal of Microbiological Methods 2010:82:6470.、饥饿相关抵抗机制、细胞间信号传递 D. DeBeer, P. Stoodley, Z. Lewandowski, Biotech. Bioeng 1994:44:636.以及特异基因表达 D. G. Davies, A. M. Chakrabarty, G. G. Geesey, Appl. Environ. Microbiol 1993:59:1181-. Maira-Litran T, Allison DG, Gilbert P. Expression of the multiple antibiotic resistance operon (mar) during growth of Escherichia coli as a biofilm. J Appl Microbiol 2000;88:243-7.等理论已较为完善。基于这些理论基础，大量的临床和科学实验应用于探究对生物膜的清除效果影响的研究。D. Lindsay在回顾了大量文献后，总结了目前控制生物膜的方法，包括：防止最初的微生物附着、抑制生物膜的形成、针对性的清除EPS和改变检测的方案等4。但是尚未有较好的、确切的解决该问题的方法，因为生物膜对外界抵抗作用是复杂的、多因素的，当其暴露在不良环境中，其本身的结构即朝着抵抗该环境和抵抗微生物制剂的方向变异，这些因素都增加了实验研究的困难程度 Gilbert P, McBain AJ. Biofilms: their impact on health and their recalcitrance toward biocides. Am J Infect Control 2001;29:252-255.。因此仍未能有较好的、确切的解决该问题的方法。国内研究概况：1. 内镜技术发展及使用普及，医院感染控制重视不足。在上海，平均每30位住院病人或每70个门诊就诊病人中就有1人接受内镜检查赖晓全.内窥镜污染的现状及控制J.中国消毒学杂志，2004，21(1)：60-62.，且该项比例仍在上升。部分医院存在日诊量过高，内镜数量相对不足的矛盾，造成了内镜清洗消毒时间不够，消毒效果不达标等问题 廖如燕，张贤昌，林锦炎，钟昱文，张里君.广东省医院内窥镜污染与消毒现状调查J.华南预防医学,2005,31(5):60-63.。我国医疗机构普遍存在对内镜清洗消毒重视度不够、资源限制、对规范执行力不强等不良现象，导致了内镜消毒合格率普遍偏低 黄俊毅,陈坤.浙江省医疗机构2008年内镜消毒管理现况调查J.浙江预防医学，2009,21（9）：40-45. 的结果。由此可见，我国目前的内镜清洗消毒工作仍然存在许多问题，发生医院感染的隐患普遍存在。2. 生物膜相关研究较多，但有关内镜生物膜相关研究较少。在对国内文献进行检索时，有关细菌生物膜的研究报道很多，但多为相关研究进展的报道。还有一些对其他医疗器械形成的生物膜实验研究，基本上都是体外进行，未能合理考虑临床实际情况。葛新 葛新,董小青,王玉祥.肺炎克雷伯菌生物膜对消毒剂抵抗性研究J.中国卫生检验杂志,2006,16(2):231-232. 葛新，王丹敏,詹曦菁.葡萄球菌生物膜对消毒剂抗力的研究J.中国消毒学杂志,2007,24(2):122-125.和陆烨 陆烨,虞晓珍,陆龙喜.内镜中铜绿假单胞菌生物膜对消毒剂抗性研究J.中国卫生检验杂志,2008,18(7):1348-1349.等的报道均为不同细菌生物膜对消毒剂的抵抗作用，其结果都与国外研究结果相似。曹勇的不同内镜洗涤剂对内镜管腔大肠杆菌生物膜清除力比较的实验研究 曹勇.不同内镜洗涤剂对内镜管腔大肠杆菌生物膜清除力比较D.浙江:浙江大学医学院,2009.，其研究结果与Vickery K等24的研究结果一致，即非含酶清洗剂对生物膜的清除效果较含酶清洗剂更佳。部分研究使用的材料并非临床内镜材料，不能代表临床内镜生物膜的真实情况。37 3. 前期研究对本课题开展提供了支持。前期工作中，我们参考了国内外大量文献，进行了内镜生物膜模型的建立和不同清洗剂清除内镜生物膜的实验研究。其中内镜生物膜模型的建立通过大肠杆菌在内镜Teflon管上生物膜的形成与培养时间、流速、温度的关系，研究形成了成熟稳定的黏附于内镜Teflon管上的生物膜。研究发现细菌更容易在Teflon管超微结构上微小的沟纹缝隙中积聚，因此在这些缝隙中更易形成生物膜，提示在内镜的手工清洗中要注意选择合适的刷子及适当的刷洗方式，以免划伤内镜管腔的内表面，从而降低细菌的黏附。因此，开展本课题研究有助于掌握我国内镜生物膜污染和现状，为内镜生物膜的清除提供新的思路和可靠的方法主要存在的问题：1. 缺乏临床内镜生物膜发生率和危险因素的相关研究。对于生物膜产生的条件、因素及不同等级医院和地区的生物膜发生率间的比较都未能有研究。2. 由于资源的限制和对于感染控制认识的不足，许多国家都对存在重复使用一次性医疗物品和质量不合格医疗物品的问题，尤其是价格相对昂贵的内镜治疗附件在发达国家也不乏先例。然而，不合格或重复使用的附件可能会对内镜内管道造成划痕、针刺损伤等，这些对于内镜生物膜的形成都是非常有利的，也增加了内镜生物膜预防与清除的难度。3. 缺乏针对不同手工刷洗方法的对损伤内镜管道进行处理后的效果比较。4. 缺乏针对不同手工刷洗方法的对已形成生物膜的内镜管道进行处理后的效果比较。(二) 开展此课题研究的设想、特色或创新之处：1. 本课题是在查阅大量的国内外文献的基础上，结合我国当前内镜清洗消毒现况及内镜生物膜形成所引起的交叉感染对患者造成严重的危害，由此为医院感染的控制带来的挑战，鉴于此而进行了本课题的设计。2. 内镜作为一种侵入性、微创性的诊治工具已广泛应用于临床，为疾病的诊治与预防，起到了积极的作用。但有报道指出生物膜的形成造成了临床上65%的细菌感染，已成为医院感染潜在的重要影响因素。但尚缺乏有关内镜生物膜发生原因及相关因素的调查研究。本课题通过对内镜生物膜的现状及相关因素进行调查研究，掌握临床内镜管道确切的生物膜发生率及产生的原因、内镜在临床的基本使用情况与生物膜发生的关系和不同等级医院的不同清洗消毒方法等对生物膜形成的影响。为通过临床内镜的清洗、消毒来防止生物膜的形成提供解决问题的方向和科学有效的指导，从而更好的防止内镜相关医院感染，保障医疗安全。3. 由内镜生物膜引起的感染正引起人们越来越多的关注,但与之相关的许多问题还有待于解决,特别通过手工刷洗对内镜生物膜进行干预的实验性研究国内外均尚未见报道。本实验通过对临床使用后的内镜和制作的内镜生物膜模型分别进行干预处理，同时对不同干预种类、次数等水平进行不同设置，采用内镜常规处理措施的多因素多水平的干预，分析手工刷洗方法对内镜生物膜的清除效果。接近临床实际，对内镜的清洗消毒具有切实可行的指导意义，为通过临床内镜的有效清洗来防止生物膜的形成提供可靠的理论依据。(三) 参考文献1. 中华人民共和国卫生部内镜清洗消毒技术操作规范S卫医发2004100号2004：5-92. J.W. Costerton, P.S. Stewart, E.P. Greenberg. Bacterial Biofilms: A Common Cause Of Persistent Infections. Science 1999:284:13181322.3. Rodney M. Donlan and J. William Costerton. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews 2002:15:167193.4. D. Lindsay, A. von Holy. Bacterial biofilms within the clinical setting: what healthcare professionals should know. Journal of Hospital Infection 2006:64:313-325.5. ESGE Guidenlines Committee. Technical note on Cleaning and Disinfection. Acta Endoscopica 2003:33:639-6506. J.C. Darbord. Importance of cleaning for reprocessing endoscopes and thermolabile sterile medical devices: French use and regulations. Journal of Hospital Infection 2004:56:S40S43.7. U. Heudorf, M. Exner. German guidelines for reprocessing endoscopes and endoscopic accessories: guideline compliance in Frankfurt/Main, Germany. Journal of Hospital Infection 2006:64:69-75.8. Tandon RK, Ahuja V. Non-United States guidelines for endoscope reprocessing. Gastrointest Endosc Clin N Am 2000;10:295-318.9. Alvarado CJ, Reichelderfer M. APIC guidelines for infection prevention and control in flexible endoscopes. Am J Infect Control 2000;28:138-155.10. Douglas B. Nelson. Recent advances in epidemiology and prevention of gastrointestinal related infections. Current Opinions in Infectious Diseases 2005:18:326-330.11. Standards of infection control in reprocessing of flexible gastrointestinal endoscopes. Gastroenterology Nursing 2010:33:70-80.12. The American Society for Gastrointestinal Endoscopy (ASGE). Automated endoscope reprocessors. Gastrointestinal Endoscopy 2010:72:675-680.13. FRANK M. MOSES, MD, and JENNIFER S. LEE, RN. Current GI Endoscope Disinfection and QA Practices. Digestive Diseases and Sciences, Vol. 49, Nos. 11/12 (November/December 2004), pp. 17911797.14. Timothy S Charlton. A comparison of the efficacy of lumen-cleaning devices for flexible gastrointestinal endoscopes. Australian Infection Control 2007:12:81-90.15. Tom Coenye, Hans J. Nelis. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of Microbiological Methods 2010:83:89105.16. Linda Bisset, Yvonne E. Cossart, Warwick Selby, Richard West, Denise Catterson, Kate OHara, Karen Vickery. A prospective study of the efficacy of routine decontamination for gastrointestinal endoscopes and the risk factors for failure. Am J Infect Control 2006:34:274-80.17. Pajkos, K. Vickery, Y. Cossart. Is biofilm accumulation on endoscope tubing a contributor to the failure of cleaning and decontamination? Journal of Hospital Infection 2004:58:224229.18. K. A. WHITEHEAD, J. VERRAN. The effect of surface topography on the retention of microorganisms. Food and Bioproducts Processing 2006:84(C4): 253259.19. American Society for Gastrointestinal Endoscopy (ASGE). Infection control during GI endoscopy. Gastrointestinal Endoscopy 2008:67:781-790.20. K. Marion, J. Freney, G. James, E. Bergeron, F.N.R. Renaud, J.W. Costerton. Using an efficient biofilm detaching agent: an essential step for the improvement of endoscope reprocessing protocols. Journal of Hospital Infection 2006:64:136-142.21. G. Kampf, R. Blo, H. Martiny. Surface fixation of dried blood by glutaraldehyde and peracetic acid. Journal of Hospital Infection 2004:57:139143.22. Marion K, Pasmore M, Freney J, et al. A new procedure allowing the complete removal and prevention of hemodialysis biofilms. Blood Purif 2005;23:339-348. 23. Jaeeun Kim, Betsey Pitts, Philip S. Stewart, Anne Camper, and Jeyong Yoon. Comparison of the Antimicrobial Effects of Chlorine, Silver Ion, and Tobramycin on Biofilm. Antimicrobial Agents And Chemotherapy 2008:52:14461453.24. Vickery K, Pajkos A, Cossart Y, et al. Removal of biofilm from endoscopes: evaluation of detergent efficiency. Am J Infect Control 2004;32:170-176.25. K.C. Marshall, R. Stout, R. Mitchell. Mechanism of the initial events in the sorption of marine bacteria to surfaces. J. Gen. Microbiol. 1971:68:337348.26. Katsutoshi Hori, Shinya Matsumoto. Bacterial adhesion: From mechanism to control. Biochemical Engineering Journal 48 (2010) 424434.27. Bridier, F. Dubois-Brissonnet, A. Boubetra, V. Thomas, R. Briandet. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. Journal of Microbiological Methods 2010:82:6470.28. D. DeBeer, P. Stoodley, Z. Lewandowski, Biotech. Bioeng 1994:44:636.29. D. G. Davies, A. M. Chakrabarty, G. G. Geesey, Appl. Environ. Microbiol 1993:59:1181-.30. Maira-Litran T, Allison DG, Gilbert P. Expression of the multiple antibiotic resistance operon (mar) during growth of Escherichia coli as a biofilm. J Appl Microbiol 2000;88:243-7.31. Gilbert P, McBain AJ. Biofilms: their impact on health and their recalcitrance toward biocides. 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