基因工程在番茄育种中的应用.doc

基因工程在番茄育种中的应用摘要：文章简单介绍了基因工程的概念，特点及其意义，并对基因工程在番茄抗虫害，抗病害，抗除草剂，抗逆性，雄性不育，改善番茄品质和终结种子育种上的原理，应用级研究进展进行了综述，同时探讨了基因工程在番茄育种中存在的问题，解决方法和发展前景，并且对基因工程在番茄育种中的应用进行了简单总结与概括。关键词：基因工程；番茄；育种 基因工程是指用人工方法把不同生物的遗传物质分离出来，在体外进行切割、拼接，然后按照人们的意愿重新组合成重组体，再把重组体放回到宿主细胞内进行大量复制，并使遗传信息在新宿主细胞或个体中高效表达，最终获得基因产物。这种人工创造新生物并给与生物新功能的过程称为基因工程，或称为分子水平上的遗传工程。 基因工程又称作DNA体外重组技术。这种DNA分子的新组合克服了固有的生物种间的限制，扩大和带来了定向创造新生物的可能。这是基因工程的最大的特点。此外，基因工程还已经深入到细胞水平、亚细胞水平，特别是基因水平来改造生物的本性，同时大大的扩大了育种的范围，打破了物种之间杂交的障碍，加快了育种的进程。学科起源:基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于20世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。一般来说，基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质-DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中安家落户，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。这个定义表明，基因工程具有以下几个重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生物中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系，这种能力是基因工程的第一个重要特征。第二个特征是，一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，这样实现很少量DNA样品拷贝出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝对纯净的DNA分子群体。科学家将改变人类生殖细胞DNA的技术称为“基因系治疗”（germlinetherapy），通常所说的“基因工程”则是针对改变动植物生殖细胞的。无论称谓如何，改变个体生殖细胞的DNA都将可能使其后代发生同样的改变。 据统计至少已有35个科120多种植物转基因获得成功，其中包括番茄、辣椒、茄子、马铃薯等一批重要的蔬菜作物。番茄作为一种蔬菜作物，在基因工程拓宽种质资源上得到了极大的发展。一方面是因为它栽培广泛；另一方面是因为它在遗传理论上的研究较为深入，为基因工程的拓宽研究打下了坚实的基础。 迄今，利用基因工程进行番茄品种特性改良的研究取得了很大的进展，已经获得抗虫害、抗病毒病、抗真菌病、抗除草剂、抗逆、延长贮藏期、改善风味和雄性不育转基因番茄。文章概述了利用基因工程技术进行番茄育种的研究进展。1. 番茄抗虫基因工程 由于常规育种方法在抗虫育种中难以在短时间内奏效，因此，育种家近年来把抗虫育种的重点放在利用基因工程选育抗虫新品种上，且取得了重大进展，尤其是在番茄等蔬菜上。1.1 Bt毒蛋白基因 在蔬菜抗虫育种中，苏云金杆菌晶体毒蛋白(Bt)基因应用最为广泛，不同类的Bt基因具有不同的杀虫谱，其抗虫机制是诱导细胞膜产生非特异性小空，扰乱细胞的渗透平衡，引起细胞膨胀，裂解，最后导致昆虫死亡。最早是美国Monsanto公司研究人员1987年报道的将Bt.Kurstaki HD-B缺失的CryIAd导入番茄，转基因植株对烟草天蛾、烟草夜蛾、番茄果蝇螟显示出了不同的抗性。大田试验结果证明，在转基因番茄两个株系上的虫害可得到有效的控制。印度的Mandaokar A D等通过子叶外植体与农杆菌共培养，将Bt基因转入番茄，PCR检测及Southern杂交分析证明，目的基因已被整合到番茄的基因组中，抗性试验及酶联免疫分析结果显示，外源毒素水平可占总可溶性蛋白的0.04%0.41%，外源基因表达水平高的转基因植株对番茄螟虫的幼虫的致死率可达100%，外源基因表达水平低的转基因植株对番茄螟虫幼虫也有不同程度的抗性。同时T0代转基因植株自交得到的T1进行抗虫试验，结果表明，部分T1代对番茄螟虫仍具有较高的抗性。Vander等将修饰的毒蛋白基因CryIA(b)和CryIC转入番茄中，从而产生对甜菜夜蛾、烟草夜蛾的抗性。Jansens等通过转CryIA(b)基因得到抗番茄钻心虫的转基因植株。Rhim等将毒蛋白基因和能与内毒素抗体发生交叉反应的一种74000u蛋白质的基因整合转化番茄，转化植株能抗马铃薯甲虫的幼虫。梁小友将抗病毒的CMV-CP基因和抗虫的Bt-toxin基因依次插入植物表达载体上，以土壤农杆菌介导转化番茄，并证明得到表达。 目前已经有近180个经过改造的Bt基因被克隆和测序，经过改造的Bt基因，其抗虫效果比改造前的提高100多倍。Crickmore等将这些已经克隆的基因划分为30大类，CryI基因作用于鳞翅目昆虫，Cry基因作用于鳞翅目和双翅目昆虫，Cry基因作用于鞘翅目昆虫；Cry基因作用于双翅目昆虫，现已经导入了很多植物中，包括番茄、马铃薯、青花菜、结球甘蓝、白菜、菜心等。1.2 淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因主要有两类，一是来源于小麦，一是来源于菜豆(BAAI)。将BAAI导入豌豆中，抗豆象(Callosobruchus spp.)的能力增强了。这种淀粉酶抑制剂是通过阻断幼虫中肠的进食而起作用的。Williamson等将野生番茄品种的抗线虫基因Mi转入普通番茄中，转化的植株能抗根结线虫。1.3 凝集素 凝集素是另外一大类通过抗虫基因工程改造的昆虫毒素蛋白家族，也叫做糖蛋白(Glycoprotein)。近年来比较关注的一种凝集素来自雪花莲(Galanthus nivalis，GNA)它能抵抗蚜虫的侵害。通过基因工程的方法在多种植物中(如马铃薯，番茄，油菜)等已经成功的表达了这种编码凝集素蛋白的基因。这种蛋白的一个重要特性就是能组织昆虫在植物上的穿刺和吸吮树汁，但不利的方面是只有当凝集素的表达量很高的时候才起作用，如在昆虫食物中需要含毫克级的量才能进行生物学鉴定。吴昌银等通过根癌农杆菌，采用叶盘法将雪花莲外源凝集素基因导入番茄，获得了含GNA基因的43株转化植株。抗蚜虫试验证明，转基因番茄具有一定的抗蚜虫能力，同时证明了所导入的外源基因在后代中稳定遗传。目前，虽然已经克隆了许多凝集素基因并在转基因植物中得以表达，但是杀虫性能依然很低。2. 番茄抗病基因工程2.1 番茄抗病毒基因工程在抗病基因工程中，抗病毒基因工程进展最快，取得的成果最多，尤其是通过导入病毒外壳蛋白基因(cp)获得的抗病毒蛋白基因植株方面，获得了很多转基因蔬菜作物，其作用机制是利用原无毒的病毒外壳蛋白抑制病毒的复制。华盛顿大学Powell等通过植物基因工程技术，首次将烟草花叶病毒(Tobacoo Mosaic Virus,TMV)外壳蛋白(Coat protei,cp)基因转入烟草和番茄，培育出能稳定遗传的抗病毒植株。随着研究工作的不断深入，发现马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒(Tobacco EtchVirus，TEV)、马铃薯卷叶病毒(Potato Leaf RollVirus，PLRV)和番茄斑萎病毒(Tomoto Spotted WithVirus, TSWV)缺失的不完整的外壳(缺失AUG密码子)或者黄瓜花叶病毒外壳基因的反义基因整合到植物染色体上后，能使转基因植株获得很好的抗性，甚至达到完全免疫。抗病毒型可通过自交稳定的遗传给子代，Tumer等用苜蓿花叶病毒(Alfalfa Mosaic Vitus AIMV)外壳蛋白基因序列转化的番茄植株作试验，其自交后代对AIMV感染表现出高水平的保护抗性。除此外壳蛋白基因外，将病毒基因反义RNA，卫星RNA病毒复制酶基因和来源于植物的抗病毒基因导入植物都取得了一定的进展。卫星RNA是依赖于病毒才能复制的一类低分子量的RNA，它能干扰病毒的复制和使症状减轻。赵淑珍利用CMV卫星RNA-1的cDNA单体基因转化番茄，接种试验发现转基因番茄的症状减轻，田间试验也表现了对CMV的抗性。此外，人们还利用其他的抗病毒基因获得了转基因番茄，姜国勇等双抗表达载体的构建及番茄的转化鉴定，利用天然花粉蛋白基因(TCS)和GUS基因偶联，通过农杆菌介导，获得了TCS-GUS基因双双表达的再生植株，转基因植株对TMV和CMV均表现出较高的抗性。现在，人们还试图从病毒蛋白基因、核酸裂解酶基因、病毒复制基因等方面寻找更好的抗病毒新途径。2.2 番茄抗真菌和细菌基因工程番茄的真菌病害种类较多，且影响面积大、农药防效差、产量损失重，因此培育抗真菌病害的品种显得尤为重要。抗真菌的植物基因工程目前正处于基因分离与鉴定阶段，已鉴定出几丁质酶基因、-萄聚糖酶基因等。Logemann等从烟草中分离出I级几丁质酶(1.5%4.0%可溶性蛋白)和级-l，3萄聚糖酶(0.l%2.0%可溶性蛋白)，将其在转基因番茄中同时表达，显著提高了植物对尖镰孢菌的抗性，在胡萝卜中也得到了类似的结果。这是因为几丁质酶和-l，3萄聚糖酶可分别催化几丁质和-1，3 萄聚糖的水解反应，这两类物质是许多真菌细胞壁的主要成分，其结果导致真菌生长受阻。此外，植保素对某些真菌病害是有毒的，不同的植物产生不同的植保素，真菌对非寄主植物产生的植保素很敏感，目前已经鉴定出了200多种植保素，其中研究的最深的是类黄酮与类萜类植保素，从葡萄中分离出的3，4，5-三羟芪合成酶基因导入烟草后，转基因植株与对照相比表现出对灰霉病(Botryitis cinerea)更强的抗性。转基因番茄对灰霉病和早产疫病(Alternaria solani)的抗性都比对照强。在抗病番茄基因工程的研究中，也做了一些抗细菌病害的研究工作。Tansley等从秘鲁番茄中克隆出抗细菌斑点病病菌的基因pto，该基因编码的产物是色氨酸/苏氨酸激酶型的蛋白质，可与该菌非毒性基因产物作用，转pto基因的番茄植株能抗细菌斑点病。3. 番茄抗除草剂基因工程在现代农业中，除草剂在控制杂草的生长繁殖方面起着重要的作用，已经用于农业生产的除草剂至少有180种，通过使用除草剂，大大提高了劳动效率。利用基因工程技术培育抗除草剂植物主要有两种策略：修饰除草剂作用的靶蛋白促使其过量表达或者对除草剂不敏感，以便植物吸收除草剂后能正常生长发育，这类基因有抗草甘膦、磺酰尿类、均三氮苯类的阿特拉津除草剂基因。导入解毒蛋白基因，降解除草剂分子，这类基因有乙酰CoA 转移酶基因 (bar)、2，4-D单氧化酶基因(TfdA)和腈水解酶基因 (bxn)等。3.1 修饰除草剂的靶蛋白草甘膦是目前使用最广泛的非选择性有机磷类除草剂，能有效抑制76种杂草，草甘膦通过抑制细胞中5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)活性发生作用，当除草剂草甘膦与该酶结合时，阻断了芳香族氨基酸的合成，细胞中缺少芳香族氨基酸，导致植株死亡，EPSPS基因突变体产生对草甘膦的抗性。Fillatti将aroA突变基因经农杆菌转入番茄，获得了抗草甘膦的转基因植株。试验结果表明转基因植株及后代可耐受有效浓度为0.84kghm-2的草甘膦。Bedbrook等将烟草SURB-Hra基因导入番茄、甜菜、油菜、苜蓿、生菜、甜瓜，获得不同程度的抗磺酰脲除草剂的转基因植株，一些转基困烟草植株在田间喷施32ghm-2的药量下无毒害出现，而对照野生型植株在8ghm-2的药量已经出现毒害。3.2 解毒蛋白草丁膦(G1ufosinate)除草肽和Basta(商品名)属于同一类有机磷类除草剂，其作用机理是抑制谷氨酰胺合成酶(GS)的活性，使细胞内氨离子含量积累，引起叶绿体降解并导致植物死亡。Murakami发现潮霉菌(Hygroscopicas)中的bar基因编码的乙酰CoA转移酶具有使草丁膦代谢失去活性的功能，将bar基因导入番茄中，当叶片乙酰CoA转移酶表达量达到叶蛋白总量的0.0001%的水平，转基因番茄就能抗草丁膦除草剂。4.番茄抗逆境基因工程世界性的寒冷、高温、干旱、水涝、盐渍、土壤、水质和空气污染以及农药、除草剂的残留等，构成了植物的生存逆境，它们对农业生产破坏性极大。解决这些问题的途径，除了改善生产条件和控制环境污染以外，改变植物使之适应环境即进行抗逆育种是一条经济有效的途径。4.1 抗干旱和盐碱干旱和盐碱对植物生长影响的共同特点是渗透胁迫。植物抗渗透胁迫的基因工程在于调节渗透压分子及其基因相关的研究上。Singh首次从耐盐烟草细胞中分离出相对分子质量为26ku酸性蛋白质，其含量高达细胞总蛋白的12%以上，后来，在番茄、马铃薯、小麦、大豆、胡萝卜、棉花和水稻中都发现了与烟草26ku渗透蛋白抗血清有交叉反应的蛋白，其相对分子质量均在26ku左右。一些植物在受到盐胁迫和病原体等侵犯时，体内的草酸氧化酶大量积累，并能通过其催化的反应产物H2O2，诱导促使植物的系统抗性增加。根据这一原理，Dessalegne等将草酸氧化酶基因转入番茄中，得到的转基因番茄在盐胁迫情况下其产量高于对照。4.2 抗寒 Hightower等利用农杆菌将比目鱼体内的抗冻蛋白基因转入番茄，发现转基因番茄不但稳定转录AFP的mRNA，还产生一种新的蛋白质。这种转基因番茄的组织提取液在冰冻条件下能有效阻止冰晶的增长。转基因植株经温室鉴定，抗冻能力明显提高。这是首例由基因工程提高番茄抗逆性成功的报道。此外抗冻蛋白也研究的较多。在南极或者北半球高纬度海域中生活的一些鱼类如美洲黄盖鲽鱼(Pseudopleuronectusamericanus)、床杜父鱼(Myoxocophalusscorpius)等具有很强的抗寒性，这与这些鱼的血液中存在的抗冻蛋白有关。黄永芬等采用花粉管和子房注射将美洲拟鲽afp基因转入番茄，转基因植株的致死温度比对照降低2。5.番茄雄性不育基因工程 雄性不育系的获得最初主要是利用自然变异和人工选育。随着花粉发育分子生物学研究的深入和基因工程技术的发展，人们开始利用基因工程的手段来创制植物的雄性不育系。其基本策略是通过导入外源基因，在特殊启动子的调控下，干扰、抑制花粉的正常发育或表达毒性基因破坏花粉发育，来获得雄性不育系。1915年，Crane首次在番茄上发现雄性不育现象，Mariani将P-TA29特异启动子和糖核酸酶基因Barnase连接导人番茄，培育出雄性不育的工程植株，为杂交制种提供了方便。张宏等首先获得了番茄的基因工程雄性不育株。他们利用TA292 barnase基因，用根癌农杆菌介导法，以子叶为受体，获得了番茄的雄性不育转基因植株。番茄雄性不育基因工程作为一个近几年发展起来的新兴技术，还不够成熟。但随着理论研究的深入和技术上的发展，这些缺陷必将得以解决。同传统获得雄性不育技术相结合，基因工程技术将会在番茄育种中发挥更为重要的作用。6.改变番茄成分来提高番茄品质的基因工程对于不同蔬菜作物品质的要求是不一样的，归纳起来主要是蛋白质成分、淀粉和糖类含量、脂肪酸组分、维生素水平和果实成熟期等。目前，番茄品质研究已经取得了较大的进展，Oeller等将ACC合成酶cDNA的PtACC2反向插入表达载体并转化番茄，转基因番茄果实内乙烯合成降低99.5%。果实在自然条件下不能成熟、无香味、不变红、不变软、在外源乙烯的处理下，番茄果实能成熟。首次商业化应用的改良转基因食品是1994年美国Calgene公司开发的转基因晚熟番茄“Flavr Savr”，这种番茄能够在货架上摆放2周以上不变软。7.终结种子基因工程终结者技术(Terminator technology)是在有限的时期内终止种子的生育能力或者可育性的技术，其中相关的基因被称为终结基因。这项技术是专门针对一些已知的并可用来终结控制植物在第1代或者以后几代中特定性状表达的基因。终结者技术原理在于应用合适的致死基因导致第2代种子不育。终结者技术应用了3种具有不同作用的基因：致死基因、重组酶基因、可抑制基因。据报道，通过终结种子基因，对细胞进行遗传修饰，植株可以采用组织培养的方法进行繁殖。当第l代种子成熟以后，经过某种化学物质(如四环素)处理才通过市场出售给农民。结果这些种子在农民的田间可以正常萌发成健壮的第2代植株。当第2代植株开始产生种子时，在晚期胚胎发育阶段，LEA启动子被激活，导致大量的核糖体失活蛋白合成，从而反馈抑制细胞中蛋白质合成的机器一核糖体，结果产生的第2代种子不可育。这些种子可以被用作粮食，但是不能萌发成植株。这一技术依然处在试验性阶段，最可能出现在棉花、番茄、马铃薯和大豆等植物的转基因种子或者杂交种子中。8.番茄转基因育种存在的问题及展望基因工程在蔬菜遗传育种、品种改良上的应用前景十分诱人，但从总体上看，转化成功的作物种类尚少，而且由于存在基因沉默(Gene silencing)现象，转基因的表达水平不高，尤其在F1和F2植株上表达不高甚至差异很大。基因沉默主要是转化基因的多拷贝、甲基化和重组。另一个问题是一些转化基因的组成型表达导致植物生长发育受到一定程度的影响。因此目前转基因工程的主要任务是寻找阻止基因沉默的有效途径和发展可诱导的启动子，开发更多有重要应用价值的目的基因，建立高效的再生和转化系，完善多种转化技术等，以达到蔬菜生理抗病虫的目的。目前，番茄的基因转化研究已由单一性状向多性状转化，并且向生产医药保健品的方向发展。我国国家基因工程中心已获得高抗TMV、CMV、马铃薯X病毒和抗早疫病、晚疫病两种真菌病害的番茄。随着植物基因工程的发展，植物体可望用于生产异源蛋白，如疫苗、酶、激素等，用这种方法可省去昂贵复杂的细胞培养和发酵等常规生产步骤，且由植物生产的抗原作为食物时引起的人体免疫应答比注射疫苗产生的反应要强。分子标记技术的发展促进了多种生物物种基因的定位与克隆工作，为有目的地寻找和发掘番茄内外源基因工作奠定了基础。随着转基因技术的深入发展和转基因植物的安全性进一步得到保障，番茄基因转化必将更好的弥补传统育种方法的不足，促进蔬菜新品种改良的进步和发展。参考文献：1 王琴芳，薛爱红，黄大。转基因植物产业化现状与发展趋势J.中国农业科技导报.2000（2）：332-336 2 许亦农，麻密主译.植物生物技术导论M.北京：化学工业出版社，2005:337-335.3 梁小友，米景久，朱玉贤，等，双抗（抗病毒机抗虫）植物表达载体的构建及番茄的转化鉴定J.植物学报，1994,36（11）：849-854.4 吴昌银，叶志虨，李汉霞，等。雪花莲外源凝集素基因转化番茄，植物学报，2000,42（7）：719-723.5 王傲雪，李景富。转基因番茄的机理及现状。辽宁农业科学，1998.33-36.6 百度文库。课程论文题 目基因工程在植物育种中的应用学 院农学院专 业农学班级农学091班 姓 名阿曼古丽.卡德尔江 学号093131107