《实验五双向电泳》word版.doc

实验五、双向电泳一、蛋白质组学概论随着人类基因组计划的实施，生命科学步入了后基因组时代，出现了不同于以往经典生物实验科学的全新的研究方式“生物大科学”。这种生物大科学的核心思想是整体性研究，即以生物体内某类物质为对象进行完整的研究。过去对生命活动的研究仅限于研究细胞内个别的基因或蛋白质，而基因组学和蛋白质组学的目标则是细胞内全部的基因和蛋白质。因此，生物大科学与经典实验生物学在研究思路上有一个重要的区别：前者通常不针对具体的生物学问题或科学假设，其目标主要是把全部研究对象测定清楚，被称为“发现的科学”（Discovery Science）；而后者属于“小科学”，其实施则离不开具体的生物学问题或科学假设，被称为“假设驱动的科学”(Hypothesis-driven Science)。显然，生物大科学与经典实验生物学各有其所长，前者“广”而后者“深”。如何把这二者有机地结合起来，使得人们能够更深刻更全面的揭示生命复杂体系和行为，这是后基因组时代生命科学工作者面临的重要课题，系统生物学（Systems Biology）就是针对这样一个时代需求而产生的生命科学研究领域的一门新兴学科。它以基因组学和蛋白质组学为基础，通过实验观察和数学建模的反复迭代过程来描述和预测生物系统的动态行为。蛋白质组学是系统生物学的基础和组成部分之一，在后基因组学时代的地位尤为突出。蛋白质组学的内容包括：表达蛋白质组学（expression proteomics）、结构蛋白质组学（structural proteomics）和功能蛋白质组学（functional proteomics）。双向电泳是蛋白质组学研究的经典方法之一，特别是对于表达蛋白质学的研究是不可缺少的手段。双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美 ”。双向凝胶电泳是一种由任意两个单向凝胶电泳组合而成的，即在第一向电泳后再在与第一向垂直的方向上进行第二向电泳。双向电泳的思路最早是由Smithies和Poulik提出，蛋白质第一向根据其自由迁移率（free-solution mobility），在滤纸条上进行的；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。随着聚丙烯酰胺凝胶的发明，双向电泳支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶，即双向凝胶电泳。1969年，双向电泳在原理上有了新的发展，建立了以等电聚焦为第一向的双向电泳技术（即IEF-PAGE）。20世纪70年代初，第二向电泳中使用了十二烷基硫酸钠（SDS），使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了现代双向凝胶电泳的基础.1975年OFarrell首先建立了等电聚焦/SDS-聚丙烯酰胺双向凝胶电泳（IEF/SDS-PAGE），至今仍不失为双向凝胶电泳首选的组合方式。在这项组合中，IEF为第一向电泳，是基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦法分离，第二向则按分子量不同用SDS-PAGE分离，把复杂的蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进，已成为研究蛋白质组的最有价值的核心方法。目前，双向电泳最高可达11 000个蛋白点的分辨率。所以在上世纪90年代中期Wilkins提出蛋白质组学这一概念后，双向电泳即成为这个革命性课题的开门技术。目前，双向电泳主要指OFarrell建立的等电聚焦/SDS-聚丙烯酰胺双向凝胶电泳（IEF/SDS-PAGE）的模式。其基本原理是：先将蛋白质根据其等电点在pH梯度胶内（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度）进行等电聚焦，即按照它们等电点的不同进行分离。然后按照它们的相对分子质量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离。样品中的蛋白经过等点电和分子质量的两次分离后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量等信息。值得注意的是，双向电泳分离的结果使蛋白质点而不是条带。根据Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子质量的增加。二、 样品制备1基本原理要获得高分辨率和高度重复的双向电泳图谱，蛋白质样品制备是极为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响双向电泳的结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：（1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；（2）减少对蛋白质的人为修饰；（3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据这一原则，我们制备裂解液来抽提蛋白。裂解液的基本成分为尿素、去垢剂、还原剂和两性电解质等。尿素是一种优良的变性剂，通过断裂氢键和疏水键使蛋白质变性，增加其溶解性，而不影响蛋白质所带的电荷。尿素和硫脲结合使用蛋白质的溶解性会更好，尤其是疏水性的膜蛋白。去垢剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。离子型去垢剂，如SDS使蛋白质带上负电荷，干扰第一向等电聚焦而避免使用。传统的非离子去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX-100等，近几年较多的改用如CHAPS与Zwittergent系列等兼性离子去垢剂代替。还原剂多数使用-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇（DTE）通过打断二硫键使蛋白质彻底变性。两性电解质能促进蛋白质的的溶解，吸附高浓度的尿素在溶液中形成氰酸盐离子(cyanate ions)，离心时还有助于核酸的沉淀。样品中的核酸大分子会干扰等电聚焦和双向胶的银染，加入核酸水解酶或采用超声的方法可将其降解。为避免样品制备过程中蛋白质的降解，整个过程需要在yena中（约4）进行，并可加入蛋白酶抑制剂。2操作步骤1. 将研磨管离心一分钟（不低于12000g）弃上清。2. 加入裂解液（200-300ul）充分vortex.3. 再加入样品鼠脑组织（低于100mg）充分研磨。然后可以再加入裂解液至1ml.4. 将组织悬液离心5-10min(高于12000g)去除树脂和细胞碎片。5. 收集上清。3试剂准备1. 研磨管2. 裂解液： 称取尿素4.8g、CHAPS0.4g、PMSF100mg，用纯水溶解至10ml，分装成500l 于-20储存，使用时，每500l液体加DTT5mg,IPGbuffer10l。三、 蛋白质定量1基本原理定量作为生物实验室的日常工作之一，具有非常重要的意义。在蛋白质组学研究中，我们常常需要对蛋白质进行快速定量。无论是对蛋白质表达谱的定量比较还是蛋白质理化性质的分析，都建立在准确的定量这一基础之上。蛋白质的快速定量方法主要依靠蛋白质本身的发色基团，或其与其它显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量。表-1为五种蛋白质的测定方法的比较。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三种。表-1 五种蛋白质测定方法的比较方法灵敏度原理干扰物质凯氏定氮法（Kjedahl法）0.21.0mg将蛋白质转换为氮，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）双缩脲法（Biuret法）120mg多肽键加碱性铜离子生成紫色络合物硫酸铵，Tris缓冲液和某些氨基酸Folin-酚试剂法（Lowry法）5g磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和 Phe还原硫酸铵，Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇考马斯亮蓝法(Bradford法)15g考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其max由465nm变为595nm强碱性缓冲液，TritonX-100,SDS紫外吸收法50100g蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌呤和嘧啶，各种核苷酸由于DNA具有的5-磷酸腺嘌呤，5-磷酸胞密啶和5-磷酸鸟嘌呤在紫外光谱的260 nm处产生很灵敏的特征峰，我们可以以此对DNA进行定量测定。相似的，由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，所以任何一个蛋白质都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，我们可以对其进行定量。但该法存在无法弥补的缺陷。首先，对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。其次，若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。另一种可供选择的蛋白质定量方法为Lorry法。其原理为，蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。实验室通常采用改良的Bradford法进行测定蛋白质含量。其原理为，蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。只需将eppendorf管换为ELISA板并相应的减少各个试剂的用量，这种方法可以应用到大规模高通量的试验中，可以同时进行384个样品的全自动准确定量。2操作步骤1. 将标准品BSA(5mg/ml)先稀释成0.5 mg/ml，2. 按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20l分别加到96孔板中，加DDW补足到20l。3. 加适当体积样品（4l）到96孔板的样品孔中，加DDW到20l。4. 各孔加入200l G-250染色液，室温放置3-5分钟。5. 用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。6. 根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。3试剂准备1. BSA 标准牛蛋白血清5mg/ml2. ELISA96孔板3. DDW4. G-250染色液四、 第一向：等电聚焦1基本原理从电泳观点看，蛋白质最主要的特征是它的带电行为。蛋白质是由20种不同的氨基酸按不同比例通过肽键的连接构成的。由于蛋白质的一些氨基酸侧链在一定的pH值的溶液中是可解离的，从而带有一定的电荷。构成蛋白质的所有氨基酸残基上所带正负电荷的总和便是蛋白质所带的净电荷。蛋白质在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，在低pH时，蛋白质的净电荷是正的，在高pH时，其净电荷是负的，但在某一pH时，它的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoelectric point pI）。蛋白质的等电点值取决于其氨基酸的组成，是一个物理化学常数。组成每一种蛋白质或多肽的氨基酸的数目和比例是不同的，因此蛋白质的等电点范围很宽，如某种-酸性糖蛋白（chimpanzee）的pI可低达1.8，而人胎盘溶菌酶的pI可高达11.7，这样宽广的pI范围使得可以利用它来进行蛋白质的分离和分析。等电聚焦电泳时，形成正极为酸性，负极为碱性的连续的、稳定的pH梯度。将某种蛋白质（或多种蛋白质的混合物）样品至于负极端时，因pHpI，蛋白质分子带负电，电泳时向正极移动；在移动过程中，由于pH逐渐下降，蛋白质分子所带的负电荷量逐渐减少，蛋白质分子移动速度也随之变慢；当pHpI时，蛋白质所带的净电荷为零，蛋白质即停止移动。同理当蛋白质样品至于阳极端时，因pHpI，蛋白质分子带正电，电泳时向负极泳动，移动过程中，pH不断升高，蛋白质所带的正电逐渐减少，速度也随之减慢，直到到达净电荷为零的等电点位置则停止移动。因此在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子会分别聚集于其相应的等电点位置，这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。各种不同的蛋白质在电泳结束后，形成很窄的一个区带，很稀的样品也可进行分离。在等电聚焦中蛋白质区带的位置，是由电泳的pH梯度的分布和蛋白质的pI所决定的，而与蛋白质分子的大小和形状无关。蛋白质到达它的等电点位置后，没有净电荷，就不能进一步迁移。如果蛋白带向阴极扩散，将进入高pH范围而带负电，阳极就会将其吸引回去，直到回到净电荷为零的位置，同理，如果它向阳极扩散而带正电，阴极则将其吸引回净电荷为零的位置。因此蛋白质只能在它的等电点位置会被聚集成一条窄而稳定的带（见图-1）。所以等电聚焦不仅能获得不同蛋白质分离和纯化效果，同时也能得到蛋白质的浓缩效果。这种聚焦效应或称浓缩效应是等电聚焦最大的优点，是高分辨率的保证。根据建立pH梯度原理的不同，梯度又分为载体两性电解质pH梯度（Carrier ampholytes pH gradients）和固相pH梯度（immobilized pH gradients）。前者是在电场中通过两性缓冲离子游离建立pH梯度（线性）。后者是将缓冲基团共价键合在介质上成为凝胶介质的一部分而建立pH梯度（线性和非线性），分辨率比前者高一个数量级。由于合成载体两性电解质（synthetic carrier ampholyte SCA）是通过复杂的合成过程得到的，其重复性很难控制，由此不同批次之间会存在很大的变化，同一蛋白质在不同批图-1. 等电聚焦的“聚焦效应”次等电聚焦中所出现的位置有所偏差，这样作为双向电泳中的一向时就限制了蛋白质分离的重复性。另外，SCA分子量相对较小，难以在IEF胶内固定，再等电聚焦过程中由于水合正离子引起电渗流（electroendosmosis）将致使SCA分子向负极迁移（负极漂移），结果使pH值的不稳定性增加。基于以上的种种因素，20世纪80年代建立起一种新型的等电计较技术固相pH梯度等电聚焦。固相pH梯度等电聚焦（Immobilized pH gradients isoelectric focusing, IPGIEF）是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成pH梯度，然后将其共价键合在介质上，成为凝胶介质的一部分，从而形成固定的，不随环境电场等条件变化的pH梯度。与传统的载体两性电解质等电聚焦相比，具有更高的分辨率和可重复性，更好的pH值的稳定性，更大的上样量等优点。分辨率可达0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方式，可用于分析和制备等电点极其相近的蛋白质和多肽，是目前唯一可以分析只有一个氨基酸差异的两种蛋白质的的电泳方法。固相pH梯度等电聚焦技术的突破要归功于Immobilines试剂（Amersham Pharmacia Biotech, APB）的基础上开发的固相pH梯度（IPG）技术。Immobilines（固相试剂）是一系列性质稳定的具有弱酸弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有类的聚合行为。每个分子都有一个单一的酸性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连，其结构式为： 其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的双键可以在聚合过程中共价键合镶嵌到聚丙烯酰胺介质中。所以它是固相的，即使是在电场中也不会漂移。分子另一端的R基团为弱酸或弱碱性的缓冲基团，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可形成近似线性的分布在pH310范围的缓冲体系。见图-2。在固相pH梯度的发展中，为了改善结果，简化操作，把IPG胶灌到塑料支持膜上形成商品化的固定干胶条，即IPG胶条。固定干胶条（immobiline PH gradients,IPG）的概念：胶条由基质和聚丙稀酰胺形成一个整体，PH梯度的产生是由酸性和碱性基团与聚丙稀酰胺以梯度式共价键连接而形成。即使在电场中，它也是“固相”的。图-2 固相pH梯度聚丙烯酰胺凝胶基质结合缓冲基团2 操作步骤1. 加样品水化 用水化液溶解样品，一般18cm的胶条加水化液后的终体积是350l。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。2. 将溶解好的样品加入放入标准型胶条槽中。3. 从酸性端（尖端）一侧剥去IPG胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG胶条尖端（阳性端）朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢压下胶条，并前后移动，避免产生气泡，最后放下IPG胶条平端（阴极），使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。4. IPG胶条上覆盖适量 矿物油，盖上盖子。5. 将标准型胶条槽的尖端背面电极与IPGphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与仪器的阴极平台接触。6. 设置PGphor仪器运行参数：胶条水化的电压，温度和时间：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。7. 暂时不进行第二向的IPG胶条可夹在两层塑料薄膜中于80保存几个月。3试剂准备1. 水化液（8M尿素，2%CHAPS，15mM DTT和0.5%IPG缓冲液）: 水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20度保存，但不可反复冻融)。2. IPG胶条3. 矿物油五 、 IPG胶条的平衡1基本原理第一向电泳后蛋白质得到了初步分离，凝胶条中所含的蛋白质区带，是第二向电泳的样品，因此，进行第二向电泳前，要将第一向电泳后的凝胶条包埋在第二向电泳的凝胶板中。因为两向电泳的分离系统不同，需将第一向电泳后的凝胶预先在第一向电泳分离系统中振荡平衡，再包埋于第二向电泳凝胶板的电泳起始端，然后按照SDS-PAGE的方法进行电泳。 平衡液的体积随胶条的长度而异。平衡的过程分为两步：第一步平衡液的成分主要是Tris缓冲液、SDS、DTT、尿素和甘油。平衡的主要作用是使第一向胶条上的蛋白质变性。平衡液中的尿素和甘油可以增加溶液的黏度，减少电内渗。电内渗作用是由固相化的两性电解质造成的，它影响蛋白质从第一向到第二向转移。SDS用于变性蛋白质，是蛋白质带上负电荷，这对第二向SDS-PAGE来讲是十分重要的。DTT是为了在蛋白质与SDS充分结合的同时，二硫键也得到还原；第二步的平衡液是用IAA（碘乙酰胺）代替DTT，这一步是用来烷基化自由DTT和蛋白质所带的自由巯基，否则，自由DTT在二向迁移过程中会产生假条纹现象，在银染后会观察出来。两次平衡的时间均为15分钟。如果图谱的竖直条纹太多则平衡时间可适当延长到20分钟，时间太短时蛋白质没有被SDS充分包裹，容易产生水平条纹。2 操作步骤1. 使用前每10ml平衡缓冲液中加入100mgDTT ，取出IPG胶条分别放入平衡管中（支持膜贴着管壁，每个管中放入一根IPG胶条），在振荡仪上平衡15min后倒掉平衡缓冲液。 2. 每10ml平衡缓冲液中加入250mgIAA （碘乙酰胺），将胶条放入管中在振荡仪上平衡15min后倒掉缓冲液。 3试剂准备1. 平衡缓冲液 (0.05 M Tris-HCl , pH 8.8，6 M 尿素, 30% (w/v) 甘油和2% (w/v) SDS)：180 g尿素, 150 g甘油, 10 g SDS和16.7 ml分离胶缓冲液溶于去离子水中，最终将 体积补足到500ml。此种缓冲液可于 室温下保存两周。 2. 溴酚蓝溶液: 0.25% (w/v) 溴酚蓝溶于分离胶缓冲液中 25 mg溴酚蓝溶于10 ml 分离胶缓冲液中， 4C储存。 3. DTT4. IAA六、 第二向 SDS-PAGE1基本原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂消除电荷、形状等因素的影响，使电泳迁移率只取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂和强还原剂后具有这种作用并建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。之后，Weber，Glossmann和Douglas等人进行了多次改进，已显示出了在分离、鉴定和纯化蛋白质方面的优越性。SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子还原剂，作为变性剂和助溶性试剂，它能够断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构。强还原剂，例如-巯基乙醇（-mercapto ethanal）和二硫苏糖醇（dithiothreitol， DTT）则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS的充分结合。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和还原剂后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成蛋白质-SDS复合物,这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质分子穿上了带有负电荷的“外衣”。蛋白质-SDS复合物所带的SDS负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，另一方面，蛋白质-SDS复合物的形状是类似于“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度是恒定的，约为18埃，而长轴的长度则与蛋白质分子量大小成比例，这样的蛋白质SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或者亚基的分子质量的大小。因此，SDS-PAGE可以按蛋白质的分子大小的不同将其分开。当蛋白质亚基的分子质量在15kDa到200kDa之间时，电泳迁移率与分子质量的对数呈线性关系。若用已知分子量的一组蛋白质作图绘制标准曲线，在同样条件下检测未知样品，就可从标准曲线推算出未知样品的分子量。 2操作步骤1. 灌胶 事先装好灌胶模具，倒入凝胶溶液。灌胶后立即在每块凝胶上铺上一层水饱和正丁醇或异丁醇，以减少凝胶暴露于氧气，形成平展的凝胶面。同时灌注多块凝胶时，在室温下至少聚合3个小时。聚合后倒掉覆盖在凝胶上的正丁醇溶液，并用凝胶储存液冲洗凝胶表面。暂时不用的凝胶可用塑料薄膜包好于4保存1-2天。将整个凝胶模具完全浸没在凝胶储存液中可 4条件下保存1-2周。 2. IPG胶条的转移 用去离子水润洗一下胶条，将胶条的边缘至于滤纸上几分钟，去除多余的平衡液。然后将胶条放在玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将IPG胶条轻轻的向下推，使整个胶条的下部边缘与凝胶上表面完全接触。确保在IPG胶条与凝胶表面之间及玻璃板与塑料支持膜之间无气泡产生。3. 加入分子量标准蛋白 分子量标准蛋白溶液与等体积的1%琼脂糖溶液混合后，加入到IEF上样纸片上，然后将上样纸片用镊子放置在IPG胶条末端一侧，与凝胶表面接触。4. 封顶 最后用琼脂糖密封液进行封顶，用少量的密封液是IPG胶条被完全覆盖住，在此过程忠不要产生气泡。5. 电泳步骤 待琼脂糖凝固后，电泳槽中装满电泳缓冲液，并打开温控系统，调节温度在15。将胶盒插入电泳槽中，调节电泳参数，电流（mA/gel)15mA 时间（h:min) 15min ， 30mA 3h6. 打开电源开始电泳，当溴芬兰染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。7. 将跑好的胶转移到染色盒中固定，准备染色。3试剂准备1. 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液 30%丙烯酰胺和0.8%甲叉双丙烯酰胺溶液，将60g丙烯酰胺和1.6g甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离子水将体积不足到200ml.2. 分离胶缓冲液 1.5M Tris-HCl ,Ph8.6和0.4%（w/v）SDS：90.85g Tris和2gSDS溶于400ml去离子水中，用6N HCl调节pH到8.6，最后用去离子水将体积补足到500ml.3. 10%（w/v）过硫酸铵溶液： 1g过硫酸铵溶于10ml去离子水中。此溶液需使用前新鲜配制。4. TEMED5. 覆盖液（缓冲液饱和的异丁醇）： 混合20ml上述分离胶缓冲液和30ml异丁醇，等几分钟后去掉异丁醇层。 6. 取代液（50%(v/v)甘油和0.01%溴酚蓝水溶液）： 混合250ml甘油（100%）和250ml去离子水，再加入50mg溴酚蓝，搅拌几分钟。 7. 低熔点琼脂糖溶液：含有0.5%(w/v)低熔点琼脂糖的电极缓冲液。8. 低分子量标准蛋白七、 胶上蛋白质的检测1基本原理显示双向凝胶上的蛋白质点的方法有多种，例如，考马斯亮蓝R-250(CBB R-250)、CBB G-250、酰胺黑（Amido Black）、丽春红S(Ponceau S) 、银染、负染、荧光染料染色以及放射性同位素标记等。用于二维电泳常规检测和定量的普遍方法是考马斯亮蓝染色和银染。近年来由于测序技术和质谱灵敏度的提高，尤其是最新的Q-TOF类液相色谱串联质谱技术的发展，大大提高了质谱鉴定的灵敏度，从而使蛋白质显色的地位从简单的蛋白质点呈现转换为集成化的蛋白质微量化学表征过程的关键步骤。随着高灵敏度蛋白质分析方法和电泳后技术的结合，考马斯亮蓝染色和银染在蛋白质组学研究中的局限性日益暴露出来。而新的染色技术如荧光标记、同位素标记技术在提高灵敏度的同时，也与自动化的蛋白质平台切胶技术相兼容，染色技术向高灵敏度和自动化方向发展。不同的染色方法对设备和仪器要求不同，在实验中综合考虑各种因素，以选择最佳方案。下表给出了各种不同类型染色方法的灵敏度、对软硬件的要求、质谱兼容性等性能指标。见表-2。 表-2 不同染色方法的性能一览表我们本次实验使用的是银染。银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。 由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D凝胶分析上。待找到自己感兴趣的蛋白质点后，再通过考染富集该目的点，然后做进一步的肽段指纹图谱分析（PMF）或序列测定。随着质谱技术的不断完善和发展，对银染后的f mol级的蛋白质点直接测定已非难事。2操作步骤 固定1) 每条胶用150 mL固定液（ 50% 甲醇 和 5% 乙酸）固定20 min。2) 150 mL 50% 甲醇冲洗10 min， 3) 去离子水冲洗10min。 敏化4) 150 mL 0.02%硫代硫酸钠敏化1 min。5) 超纯水漂洗2次，每次1min。 银染6) 将胶条浸入 150mL 0.1%硝酸银和 0.08% 甲醛 (37%) 20 min。7) 超纯水漂洗两次，每次1min。 显色，需要新鲜配制8) 150 mL 2% 碳酸钠和0.04%甲醛 (37%)浸泡 直至显色。 终止9) 胶条用150 mL 5%醋酸冲洗10 min。10) 超纯水冲洗， 保存扫描完毕的胶可用保鲜膜包好于4下保存。3试剂准备1. 甲醇、醋酸、甲醛、均需用分析纯。2. 0.02% 硫代硫酸钠:：每张胶, 称取 30mg 硫代硫酸钠5H2O 用去离子水溶解至终体积150 mL 。八、 2-DE凝胶的检测目测或通过计算机辅助自动化检测：（1）目测：是比较精确的，蛋白质斑点强度有10%的变化就可以可靠地检测出来。对不同凝胶上寻找对应斑点时，目测比自动匹配要容易得多。而且，目测也不要昂贵的软件和硬件，但随着需要检测的蛋白质斑点的增多、凝胶的增大，目测工作也越来越繁重。要在20块30 cm40cm的凝胶中比较一个蛋白质斑点的强度几乎不可能；（2）自动化检测：通过监视器把感兴趣的斑点放在20个窗口中比较，同时也可控制计算机强度差值。对自动化检测来说，最好的凝胶质量、最佳的斑点检测参数以及交互式人机对话是必要的。其过程分为5步：1）扫描数据的数字化；2）背景和污点的校正；3）斑点的检测；4）定量表示；5）不同凝胶的匹配比较。（3）2-DE的数据库 来自2-DE凝胶上蛋白质减法分析（附加斑点、丢失斑点、强度差异）、鉴定和特性的大量数据储存在2-DE数据库中，在Electrophoresis杂志上每年发表一次，其中部分数据可在互联网上通过WWW技术获得。例如：人类心脏蛋白质2-DE数据库中有3239个蛋白质，到目前为止，已有66个被注册。在这个数据库中，注释所使用的标准有：扩张性心肌病相关蛋白质、N末端序列、内部序列、氨基酸组成、蛋白质名称、分子量、等电点以及与鉴定有关的参照。可将其从这个数据库直接转到我们的数据库进行比较。九、思考题1 简述蛋白质组学双向电泳技术的基本原理。2 蛋白质组学双向电泳样品制备应遵循的基本原理是什么？实施双向电泳技术操作过程中应特别注意哪些问题