实验四：酵母菌形态观察及计数.ppt

2020年4月1日星期三 酵母菌形态观察及微生物直接计数法 2010 10 2010 12 酵母菌形态观察及微生物直接计数法 3 一 目的要求 1 观察酵母菌的形态特征及出芽方式 2 了解血球计数板计数原理 掌握显微计数的原理及方法 4 二 实验原理 1 酵母菌酵母菌是单细胞真核生物 菌体比细菌大且不运动 繁殖方式以无性为 芽殖或裂殖 有性繁殖产生子囊和子囊孢子 5 2 酵母死活细胞鉴别的理论依据 本实验通过美蓝染液水浸片观察酵母的形态和出芽生殖方式 美蓝是一种无毒性的染料 它的氧化型呈蓝色 还原型无色 用美蓝对酵母的活细胞进行染色时 由于细胞的新陈代谢作用 细胞内具有较强的还原能力 能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型 因此具有还原能力的酵母活细胞是无色的 而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色 借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别 6 直接计数法是利用血球计数板在显微镜下直接计数的一种简便 快速 直观的方法 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液 如有杂菌或杂质 常不易分辨 菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板 一般细菌则采用彼得罗夫 霍泽 PetrofHausser 细菌计数板 两种计数板的原理和部件相同 只是细菌计数板较薄 可以使用油镜观察 而血球计数板较厚 不能使用油镜 计数板下部的细菌不易看清 3 直接计数法 7 4 血球计数板的构造 8 血球计数板是一块特制的厚型载玻片 载玻片上有4条槽而构成3个平台 中间的平台较宽 其中间又被一短横槽分隔成两半 每个半边上面各有一个计数区 图21 1 计数区的刻度有两种 一种是计数区分为16个大方格 大方格用三线隔开 而每个大方格又分成25个小方格 另一种是一个计数区分成25个大方格 大方格之间用双线分开 而每个大方格又分成16个小方格 但是不管计数区是哪一种构造 它们都有一个共同特点 即计数区都由400个小方格组成 9 计数区边长为1mm 高度为0 1mm 所以每个计数区的体积为0 1mm3 在计数时 通常数五个中方格的总菌数N 然后求得每个中方格的平均值 再乘上16或25 就得出一个大方格中的总菌数 然后再换算成1ml菌液中的总菌数 最后乘以稀释倍数M 计算公式 25个中方格1ml菌液中的总数 N 5 25 10000 M 50000N M 个 16个中方格1ml菌液中的总数 N 5 16 10000 M 32000N M 个 10 5 计数原则1 在计数前若发现菌液太浓或太稀 需重新调节稀释度后再计数 一般样品稀释度要求每小格内约有5 10个菌体为宜 2 每个计数室选5个中格 可选4个角和中央的一个中格 中的菌体进行计数 3 位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的 4 如遇酵母出芽 芽体大小达到母细胞的一半时 即作为两个菌体计数 5 计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量 11 三 实验操作 1 配制培养基 灭菌 接种培养每台配制100ml马丁氏液体培养基 不加琼脂 分装到8支试管中 121 30min灭菌 灭菌后每一小组分得2支试管 液体接种酵母菌 30 恒温摇床培养 12 2 死活细胞鉴定美蓝浸片观察 1 在载玻片中央加一滴0 1 美蓝染色液 挑菌混匀 2 倾斜缓慢放置盖玻片 3 放置3min后镜检 4 染色半小时后再次进行观察 注意死活细胞数量是否增加 5 用0 05 吕氏碱性美蓝染液重复上述操作 13 3 血球计数实验操作 1 镜检计数室 去污 清洗 吹干 2 加样品 盖上盖玻片 菌悬液于边缘滴一小滴 渗入 使充满菌液 3 显微镜计数 加样后静止5min 每个小格内5 10个菌体 取5个中格 可选4个角和中央的一个中格 计数 4 清洗 5 计算菌浓度 14 思考题 1 吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同 对酵母菌死细胞数量有何影响 试分析原因 2 在显微镜下 酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌 3 某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率 请设计1 2种可行的检测方法