实验4、植物组织中过氧化氢酶的活力测定.ppt

实验七 植物组织中过氧化氢酶活力测定 高锰酸钾滴定法 一 实验目的 1 掌握酶活力测定的方法2 了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理 二 实验原理 过氧化氢酶 CAT 属于血红蛋白酶 含有铁 它能催化过氧化氢分解为水和分子氧 在此过程中起传递电子的作用 过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂 R Fe2 H2O2 R Fe3 OH R Fe3 OH 2 H2O2 R Fe2 2 2H2O O2 据此 可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小 在反应系统中加入一定量 反应过量 的H2O2溶液 经酶促反应后 用标准高锰酸钾溶液 在酸性条件下 滴定多余的H2O2 即可求出消耗的H2O2的量 5H2O2 2KMnO4 4H2SO4 5O2 2KHSO4 8H2O 2MnSO4 三 材料 试剂与器具 1 材料 小麦叶片2 试剂 1 10 H2SO4 2 0 2mol L磷酸缓冲液pH7 8 3 0 02mol L高锰酸钾标准液 称取KMnO4 AR 3 1605g 用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml 用0 1mol L草酸溶液标定 4 0 1mol LH2O2 市售30 H2O2大约等于17 6mol L 取30 H2O2溶液5 68ml 稀释至1000ml 用标准0 1mol KMnO4溶液 在酸性条件下 进行标定 5 0 1mol L草酸 称取优级纯H2C2O4 2H2O12 607g 用蒸馏水溶解后 定容至1L 3 器具 1 恒温水浴 2 研钵 三角瓶50ml 4 酸式滴定管 10ml 容量瓶25ml 1等 四 实验步骤 1 酶液提取取小麦叶片2 5g加入pH7 8的磷酸缓冲溶液少量 研磨成匀浆 转移至25ml容量瓶中 用该缓冲液冲洗研钵 并将缓冲洗液转入容量瓶中 用同一缓冲液定容 4000rpm离心15min 上清液即为过氧化氢酶的粗提液 2 反应取50ml三角瓶4个 两个测定两个对照 测定瓶中加入酶液2 5ml 对照瓶中加入煮死酶液2 5ml 再加入2 5ml0 1mol LH2O2 同时计时 于30 恒温水浴中保温10min 立即加入10 H2SO42 5ml 3 滴定用0 02mol LKMn 4标准溶液滴定H2O2 至出现粉红色 在30S内不消失 为终点 五 计算 酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示酶活 mgH2O2 g min 式中 A 对照KMnO4滴定毫升数 B 酶反应后KMnO4滴定毫升数 VT 酶液总量 ml V1 反应所用酶液量 ml FW 样品鲜重 g 1 7 1ml0 1mol L的KMnO4相当于1 7mgH2O2 六 研讨题 1 影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些 2 过氧化氢酶与哪些生化过程有关 3 过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法 即紫外吸收法 原理是H2O2在240nm波长下有强烈吸收 过氧化氢酶能分解过氧化氢 使反应溶液吸光度 A240 随反应时间而降低 根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力 请你查阅资料设计一个应用该方法测定过氧化氢酶活力的实验