《高效液相色谱法》PPT课件.ppt

高效液相色谱法 HighPerformanceLiquidChromatography HPLC 前言 HPLC是70年代以后发展最快的一个分析化学分支 现已成为生化 医学 药物 化学化工 食品卫生 环保检测等领域最常用的分离分析手段 我国 开始仅为少数研究实验室拥有 现很多的生产 研究 质检部门 广泛应用于质量控制 分析化验 制备分离 例 讲课目的 入门教材问题 学习要求 课时安排 第一章 高效液相色谱的基本原理6学时第二章 高效液相色谱的仪器装置2学时第三章 液固 液液 键合相色谱4学时第四章 离子交换色谱和离子对色谱3学时第五章 凝胶渗透色谱1学时第六章 实验技术和辅助实验技术2学时机动2学时第3 5 7周实验 参考书籍 1 色谱理论基础 卢佩章 戴朝政编 2 高效液相色谱法 邹汉法 张玉奎 卢佩章编著 3 高效液相色谱方法及应用 色谱技术丛书 化学工业出版社 于世林编著 本课程基本要求 1 掌握色谱法的分类及有关术语 2 了解柱效的影响因素 3 掌握分离度的影响因素 4 了解定性 定量分析方法 5 掌握液相色谱仪的基本结构及功能 6 掌握常用的液相色谱法基本概念及分离对象7 掌握液相色谱的基本操作技能 第一章高效液相色谱法基本原理 1 1概述一 发展历史 100多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用的实验方法 Tswett用希腊语chroma 色 和graphos 谱 描述他的实验方法即 Chromatography 色谱法 色谱法的发展 1906年正式命名20世纪30年代开始广泛研究和应用 柱色谱 薄层色谱 气相色谱 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代 现代液相色谱分析方法 经典液相色谱法为基础 引入气相色谱法的理论和实验技术 高压输送流动相 高效固定相及高灵敏度检测器 二 色谱法概述 混合物最有效的分离 分析方法 色谱法是一种分离技术 混合物分离过程 试样中各组分在色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配 一相固定不动 称为固定相 另一相是携带试样混合物流过固定相的液体 称为流动相 高效液相色谱法的特性 高压 高效 高速 高灵敏 适用 高沸点 热不稳定样品 液相色谱仪 高效液相色谱仪流程图 三 色谱法原理 混合物中各组份在不同的两相中溶解 吸附等化学作用性能的差异 当两相相对运动时 使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离两相中一相是固定的 叫作固定相 StationaryPhase 一相是流动的 称为流动相 MobilePhase 洗脱剂 溶剂 分离原理 分离是一个物理过程 固定相 StationaryPhase 流动相 MobilePhase 进样 Injection 洗脱 Elution 相互作用 Interaction 当混合物进入色谱柱后 就在固定相 流动相之间不断地进行分配平衡 不同的化合物 分子结构不同 理化性质不同 所以在两相中存在的浓度也各不相同 固定相中存在量多的化合物 冲洗出柱子的时间就长 反之则短 这与分配系数K有关 K值小 先流出柱子 K值大的 保留作用强 后流出柱子 四 高效液相色谱法的特点 高压以液体作为流动相 液体流经色谱柱时 受到阻力较大必须对流动相施加高压 一般可达到150 300kg cm2 甚至可达700kg cm2以上 高速所需的分析时间较经典液体色谱少得多 交换速度快 流量可达l 10mL min 高效气相色谱的分离效能很高 高效液相色谱的柱效则更高 化学键合相 一般约可达6000理论塔板 米 高灵敏度 紫外检测器的最小检测量可达 10 9g 荧光检测器的灵敏度可达10 11g 所需试样很少 微升数量级高选择性可分离不同类型化合物和异构体 也可分析在性质上极为相似的化合物 同位素 同分异构体 空间异构体 手性化合物 五 HPLC与GC区别 1 分析对象的区别GC 适于能气化 热稳定性好 沸点低的样品 占有机物的20 HPLC 适于溶解后能制成溶液的样品 对分子量大 难气化 热稳定性差样品均可检测 占有机物的80 2 流动相的区别GC 流动相为惰性 组分与流动相无亲合作用力 只与固定相有相互作用 HPLC 流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力 能提高柱的选择性 改善分离度 对分离起主要作用 3 操作条件差别4 分析样品区别GC 加温操作GC 破坏样品 不能回收HPLC 室温 高压HPLC 不破坏样品 能回收说明 气相 液相地位同样重要两种互补不足的色谱方法灵敏度 气相 液相应用范围 液相 气相 六 色谱法的分类 吸附色谱 AbsorptionChromatography 组分对固定相表面吸附力的不同而分离分配色谱 PartitionChromatography 组分在固定相和流动相中的溶解度不同而分离离子交换色谱 IonExchangeChromatography 组份离子交换亲和力的差异而分离体积排除色谱 SizeExclusionChromatography 组分分子量大小不同 对固定相的渗透力不同而分离 基本概念一 色谱图 chromatogram 检测器将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号 记录仪所记录下的浓度对分离时间的函数 称为色谱图 色谱过程特点 浓度对分离时间呈高斯曲线型 色谱条件一定时 各组分都有一特定时间在图谱中出现 称为组分的保留时间 柱效一定时 组分保留值越小 峰越窄 保留值越大 峰越宽 相邻峰的保留时间相差越大 越易分离 常用术语 1 基线 仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线 2 色谱峰 响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线 正态分布 3 峰高与峰面积 峰高 色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离用h表示 峰面积 峰与峰底之间的面积 用A表示 二 色谱保留 1 保留时间 tR 从进样开始到柱后出现样品的浓度极大值所需的时间 用tR表示 2 分配系数K 组分在固定相和流动相间发生的吸附 脱附 或溶解 挥发的过程叫做分配过程 在一定温度下 组分在两相间分配达到平衡时的浓度比 单位 g mL 称为分配系数 用K表示 分配系数是色谱分离的依据 分配系数K的讨论 一定温度下 组分分配系数K越大 出峰越慢 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同 选择适宜的固定相可改善分离效果 各组分有不同K值是分离的基础 差移速度 某组分的K 0时 即不被固定相保留 最先流出 3 容量因子k capacityfactor 一定温度下 组分在两相间分配达到平衡时的质量比 1 与k 都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数 随分离柱温度 柱压的改变而变化2 与k 都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数 数值越大 该组分的保留时间越长 3 容量因子可以由实验测得 4 容量因子与保留时间的关系 推导 ux 组分在分离柱内的迁移速度 u 流动相在分离柱内的迁移速度 组分和流动相通过长度L的分离柱 需要时间分别为tR和t0 则tR to 1 k k 太小 没有充分利用填料的分离能力k 太大 分析时间太长k 范围 k 1 0 0溶剂强度 使组分迁移快慢的能力 P310表3 10 作业 思考题 1 2 3 4 5 6 8 9 5 选择性系数 可用来衡量两物质的分离程度 用 表示 色谱理论需要解决的问题 色谱分离过程的热力学和动力学问题 组分保留时间为何不同 色谱峰为何变宽 组分保留时间 色谱过程的热力学因素控制 组分和固定相的结构和性质 色谱峰变宽 色谱过程的动力学因素控制 两相中的运动阻力 扩散 两种色谱理论 塔板理论和速率理论 1 3色谱柱的分离效率 一 塔板理论 塔板理论认为 一根柱子可以分为n段 每段内组分在两相间迅速达到平衡 把每一段称为一块理论塔板 设柱长为L 理论塔板高度为H 则H L 为理论塔板数 理论塔板数一N 色谱峰对称 说明 a 在给定的操作条件下 N几乎相同b N为常量时 tw随tR成正比例变化c 与柱长有关 比较不同长度色谱柱的柱效时 应当比较它们在相同柱长下的N值 例d 是一种理想状态 有拖尾峰时 可用半峰宽来表示N N 5 54 tR W1 2 2W1 2 半峰宽 例 测得tR 105mm W1 2 4mm 求得N 3789 若此柱长为250mm 折成每米的理论塔板数约为15200 理论塔板高度H 物理意义 组分在两相间达到一次平衡对应的柱长H愈小 组分在两相间平衡分配次数越多 柱效 不能说明分离一定实现 说明 大 固定相分离潜能大 分离与否 还取决于其他色谱条件 一定色谱条件下 对k 有差异的组分 则柱效愈高 分离效果愈好 塔板理论的特点和不足 1 当L一定时 N越大 H越小 被测组分在柱内被分配的次数越多 柱效越高 所得色谱峰越窄 2 柱效不能表示被分离组分的实际分离效果 如两组分的分配系数K相同 无论该色谱柱的柱效多大 都无法分离 3 塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同的实验结果 也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径 二 峰扩展和速率方程式 1 峰扩展 由于柱内柱外各种因素引起的色谱峰变宽或变形 从而造成色谱柱效的降低峰扩展程度 取决于组分在柱内平衡分配次数例 引起峰扩展因素 柱内 柱外 柱外因素 检测器流动池体积 尽量小 柱出口到检测器的连接管 尽量短 进样器死体积 2 速率方程式 范 弟姆特方程式 H A B u C uH 理论塔板高度 u 流动相流速 cm s 减小A B C三项可提高柱效 A B C三项各与哪些因素有关 A 涡流扩散项 A 2 dpdp 固定相的平均颗粒直径 固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小dp 填充得越均匀 A H 柱效 表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻 色谱峰较窄 B u 分子扩散项 B 2 DD 试样组分分子的扩散系数 cm2 s 1 1 存在着浓度差 产生纵向扩散 2 扩散导致色谱峰变宽 H 分离变差 3 B u与流速有关 流速 滞留时间 扩散 0 5ml min 4 扩散系数D B值 液相中 分子扩散可忽略 C u 传质项 传质 溶质分子在两相间浓度不同 由浓度高的相不断迁移至浓度低的相 直到浓度达到平衡 根据传质形式分 固定相传质和移动相传质C Cs Cm 固定相传质原因 进出固定相速度不同 固相 液相 减小措施 使用薄的固定相层 小颗粒填料移动相传质 迁移滞留减小措施 填装均匀紧密 使用小颗粒填料和表面多孔性填料 3 速率理论的要点 1 柱内的峰扩展与涡流扩散 分子扩散 传质阻力有关 固液两相间的分配平衡不能瞬间达到是造成色谱峰扩展 柱效下降的主要原因 2 通过选择适当的固定相粒度 液膜厚度及流动相流速可提高柱效 3 为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导 阐明了流速和填料对柱效及分离的影响 4 各种因素相互制约 流速增大 分子扩散项的影响减小 使柱效提高 但同时传质阻力项的影响增大 又使柱效下降 选择最佳条件 才能使柱效达到最高 4 获得高柱效的几种方法 选用细的颗粒填料 流动相流速低 流动相粘度小 升高温度 溶质扩散系数与其结构有关 大分子 扩散系数小 小分子 扩散系数大 5 影响分离的因素与提高柱效的途径液体的扩散系数仅为气体的万分之一 在高效液相色谱中 速率方程中的分子扩散项B u较小 可忽略不计 即H A Cu 降低传质阻力是提高柱效主要途径 气相和液相 区别 分离度 色谱分离目的 合理的时间内将样品中组分成功分离分离度 表示分离状况的一种度量分离度影响因素 保留值之差 色谱过程的热力学因素 峰的宽度 色谱过程的动力学因素 讨论 色谱分离中的四种情况 柱效较高 K 分配系数 较大 完全分离 K不是很大 柱效较高 峰较窄 基本分离 柱效较低 K较大 但分离的不好 K小 柱效低 分离效果更差 一 分离度的表达式 R 0 8 两峰的分离程度可达89 R 1 分离程度98 达到定性定量分析的最低要求 R 1 5 达99 7 相邻两峰达到基线分离 对浓度不同组分而言 两个组分的分离度会随浓度比的增大而减小例 对多组分而言 整个色谱分离的分离度取决于Rs最小值的两个峰 二 分离度影响因素 峰的宽度 峰宽越小 Rs越大 峰的宽窄主要反映了色谱分离的动力学特性 两峰的保留时间之差 tR越大 Rs越大 反映了色谱分离的热力学特性分离度基本关系式 四 控制分离度方法 改变k 调节溶剂强度可以改变k 增大 使用较弱溶剂降低 使用较强溶剂正相色谱 固定相极性大于移动相 溶剂极性大 溶剂强度大 洗脱能力强 小 反相色谱 固定相极性小于移动相 溶剂极性大 溶剂强度小 洗脱能力弱 大 例 P307 311 更换色谱柱 改变N 措施 a 选择长柱子 N L H b 填料颗粒尽量小c 低流速 溶质传质阻力小 峰扩展小 d 低的溶剂粘度 提高柱效 e 提高柱温 改变选择性系数 1 不能实现分离 下列途径改善 a 流动相 梯度洗脱 P279 适用于极性范围宽的样品 b 固定相 换柱 改变填料 c 温度 改变热力学参数 五 分离度控制的一般原则 开始k 值很小 若要增大Rs 则首先应将k 调整至1 k 10范围 这样 不用改变其他条件 就可使Rs增大 开始k 已在1 k 10范围 但Rs不大 则必须增大N来改善Rs k N的改变都不能增大Rs时 再设法改变 作业 思考题 7 10 17 第二章仪器装置四大部件 高压输液泵进样器高效分离柱检测器 2 1高压输液泵作用 向色谱柱输送一个连续 恒定的移动相 一 对泵系统的要求1 使用方便 易调节流量 过压保护等 2 更换洗脱液容易 死体积小3 有最大工作压力 20MPa 130MPa 4 一定流量范围 直径小 流量小 速度快 流量大 0 1 10ml min 5 流量稳定性好 流量噪声 流量波动 流量漂移 6 流量精度高 机械往复式柱塞泵的工作原理 特点 能连续供给恒定体积的移动相 不受整个色谱系统中其余部分稍有变化的影响 死体积较小 约0 1ml 更换溶剂方便 适用于梯度洗脱 缺点 输出有脉冲波动二个因素 脱气不完全 泵的周期性吸液影响检测灵敏度 对紫外检测器影响不大 梯度淋洗装置 外梯度 利用两台高压输液泵 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室 混合后进入色谱柱 内梯度 一台高压泵 通过比例调节阀 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合 泵系统发展趋势 高效 填料颗粒 分离效率 柱压降 泵的工作压力 分析时间短 更快流速 柱压降 超快速分析 减少洗脱液用量 4 6mm 1mm 液相色谱的多元洗脱系统P277 280 2 2色谱柱 组成 精密管径的不锈钢管 填料 柱接头要求 柱管内壁非常光滑 柱接头设计要保证系统中引入最小死体积 柱前 柱后 能密封高压液体 两端加过滤片 柱体为直形不锈钢管 内径1 6mm 柱长5 40cm 减小填料粒度和柱径以提高柱效 柱效的影响因素 填料的颗粒度及其均匀性 柱长 填装的方法与技巧常用 内径2 5mm 4 6mm 柱效一定时 柱长与颗粒度成正比例如 颗粒度5 10um 柱长15 30cm颗粒度3 5um 柱长7 5 15cmP282 283 2 3进样装置 六通进样阀P280 281结构如图 2 4检测系统功能 连续地将色谱柱中流出的组分随时间变化的情况 转变成大小不同的电信号输入到记录仪中 得到色谱图 按检测方式不同 分为 总体性质检测器 通用型 示差折射检测器 溶质性质检测器 选择型 紫外检测器 荧光检测器 电导检测器 检测器的性能指标一个理想检测器 必须具备下列条件 灵敏度高 不受温度及流动相流速变化的影响 响应随组分量的变化而线性地变化 稳定性好 操作方便 衡量指标 灵敏度S R Q 噪音 在没有样品情况下 检测器输出的最大振幅 温度 流量 泵 漂移 检测器在一段时间内 基线随时间的增加而产生的偏离 电压 流动相 最小检测限 样品产生两倍于噪音信号时的浓度 检测下限 线性范围 检测信号呈线性变化时 最大和最小进样量之比 检测器 紫外检测器 光电二极管阵列检测器 示差折光检测器荧光检测器电导检测器 a 紫外检测器应用最广 对大部分有机化合物有响应 特点 灵敏度高 线性范围宽 流通池可做得很小 1mm 10mm 容积8 L 对流动相的流速和温度变化不敏感 波长可选 易于操作 波长范围 常用波长 200 400nm254nm 280nm可用于梯度洗脱 b 光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展 光电二极管阵列检测器 1024个二极管阵列 各检测特定波长 计算机快速处理 三维立体谱图 光电二极管阵列检测器 三维 光谱 色谱图 检测原理比尔定律 A cL紫外检测器优点 灵敏度高 10 10g ml 对梯度洗脱是一种理想检测器局限性 不能检测对紫外光没有吸收的样品 不能使用对紫外光有吸收的溶剂P289 293 第三章液固色谱和键合相色谱 3 1液固吸附色谱一 原理 固定相是极性吸附剂 不同组份官能团具有不同极性 因而对固定相的吸附能力不同 极性越大 吸附能力越强 极性越低 吸附能力越弱而导致分离 存在竞争吸附 吸附 解吸平衡 溶质 流动相分子之间 溶质中不同官能团之间竞争的结果 导致了分离 溶质在柱内受到两种力作用 固定相的吸附力 流动相的溶解力当吸附力 溶解力k 大吸附力 溶解力k 小 二 分离对象 官能团有差别的不同类型化合物 烷基类吸附弱 不能分离 几何异构体 固定相表面是刚性结构溶质分子官能团与吸附中心的相互作用随分子的几何形状而改变 三 填料的类型及其选择 按形状分 a 球形b 无定形 按多孔程度分 a 多孔型b 薄壳型 按极性分 a 极性 硅胶 Al2O3 MgO 分子筛 b 非极性 活性碳 四 硅胶的活性控制及标准化 硅胶的特点 活性控制意义 标准化方法 市售未处理硅胶 加热4 6小时 活化去水 再加进定量水分 使吸附剂含水量保持恒定 100m2表面积含水0 02 0 03g为佳 吸附强度分类 根据化合物结构类型 可将它们在硅胶上的吸附强度排序 P315归纳 官能团不同 极性不同 吸附强度不同 几何异构体 空间位置不同 吸附强度不同P314 316P331 333 分子空间效应 与官能团相邻的大烷基可能降低保留能力 位阻效应 顺式化合物的保留能力可能比反式化合物强 对位化合物的保留能力可能比邻位化合物强 五 样品分子结构对保留的影响 对吸附色谱来说 主要取决于样品分子所含的官能团的类型及其数目 常见官能团的吸附强度 不吸附 烷烃 弱吸附 烯烃 硫醇 硫醚 单环或双环芳烃 卤代芳烃 中等吸附 多环芳烃 醚 腈 硝基物 大多数羰基化合物 强吸附 醇 酚 胺 酰胺 亚枫 酸和多官能团化合物 六 液相色谱的流动相 1 流动相实用要求 1 溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性要求 2 避免使用与固定相发生不可逆反应溶剂 使用AI2O3 避免酸 使用硅胶 避免碱 3 溶剂应不干扰使用检测器的正常工作 与检测器相匹配 使用的溶剂应当易于除去 不干扰对分离组分的回收 2 流动相分类 按流动相组成分 单组分和多组分 按极性分 极性 弱极性 非极性 按使用方式分 一般淋洗和梯度淋洗 常用溶剂 正相 己烷 四氯化碳 甲苯 乙酸乙酯 正戊烷正庚烷反相 甲醇 乙腈 水溶液 LSC流动相的选择 在吸附色谱中 对溶质保留值和分离选择性起主导作用的是溶质与固定相的作用 流动相主要是调节溶质的保留值在适当范围内 溶剂强度 洗脱能力 k 液固吸附色谱的流动相 值要适当 常用正己烷 正庚烷 添加少量CH2Cl2 CHCl3 CH3CN和CH3OH 混合后的溶剂强度在两种纯溶剂之间 液固色谱的应用特点 对具有不同极性取代基的化合物表现出较高的选择性 但对同系物的分离能力较差 对强极性或离子型样品 因有时会发生不可逆吸附 液固色谱常不能获得满意的分离结果 吸附剂的含水量对吸附剂活性 样品容量和保留值有较大影响液固吸附色谱主要应用于 结构异构体 几何异构体的分离 思考 在液固色谱中 以硅胶为固定相 对以下四组分进行分离 流出色谱柱的顺序可能是 a 邻苯二胺b 对苯二胺c 间苯二胺 a 苯酚b 对羟基苯胺c 苯胺d 苯 12 作业 思考题 19 20 22 25 27 29 31 44 3 2反相键合相色谱 键合相色谱是目前HPLC中最常见的分离模式 约80 的HPLC是采用反相键合相色谱 烷基苯同系物分离分析 多环芳烃分离分析 反相键合相色谱定义 固定相通过某种化学反应将有机分子以共价键结合在色谱担体的表面 这种色谱类型称之 制备硅胶基质化学键合固定相注意点 键合反应前 将硅胶表面硅氧烷全部水解为硅烷醇 除去硅胶表面吸附水 使表面完全呈自由硅醇基 形成化学键合固定相具备条件 所用基质材料应有某种化学反应活性 有能与基质表面发生化学反应的官能团 化学键合固定相 P303 a 硅氧碳键型 Si O Cb 硅氧硅碳键型 Si O Si C稳定 耐水 耐光 耐有机溶剂 应用最广c 硅碳键型 Si Cd 硅氮键型 Si N 化学键合固定相的特点 1 传质快 表面无深凹陷 2 寿命长 化学键合 耐流动相冲击 稳定 3 选择性好 可键合不同官能团 提高选择性 4 有利于梯度洗脱 由于产生弱极性固定相 因而扩展了反相色谱分离技术的应用 反相色谱 正相色谱 存在着双重分离机制 由键合基团的覆盖率决定高覆盖率 分配为主 低覆盖率 吸附为主 常用反相键合固定相 C18 C8P300 P302 反相色谱保留机理 两种观点 疏溶剂理论 溶质与极性溶剂疏远 双保留机理 残留羟基 影响溶质保留的因素 流动相组分的保留随流动相极性的减少而减少 lnk H2O 有机溶剂 增大 极性下降 k 值随之下降 思考 在ODS柱上 用70 甲醇 水或60 甲醇 水洗脱苯系物 哪一种流动相使苯系物的保留值大 为什么 键合固定相 a 烷基覆盖量增加 k 值随之增大 b 烷基链长增加 k 值随之增大 思考 同样是70 甲醇流动相 苯在C18比C8柱上的保留值大 为什么 溶质 非离子化合物 极性大 k 值小 非极性化合物 分子表面积大 k 值大 同系物 链长增大 k 值增大 苯系物 环数增大 k 值增大 若化合物的非极性部分相同 极性官能团增加 则k 值下降 几何异构体 能形成内氢键的异构体的化合物k 值大 反相色谱中流动相选择 水 有机改善剂常用 甲醇 乙腈 四氢呋喃 二氧六环极性 有机改善剂 水洗脱能力 有机改善剂 水极性顺序 甲醇 乙腈 二氧六环 四氢呋喃洗脱能力 水 甲醇 乙腈 二氧六环 四氢呋喃 反相键合相色谱的优点 流动相可选用水溶性 样品的溶解度范围提高 流动相可变性大 柱重现性好 固定相表面化学能低 平衡容易 梯度洗脱 固定相选择多 固定相耐溶剂冲洗 热稳定性好 缺点 流动相PH范围要控制 PH 2 8 pH太低 Si C键易断裂pH太高 硅胶基质易溶解 游离的硅羟残基影响分离 封尾 P328 331 思考烷基苯同系物分离分析多环芳烃分离分析 出峰顺序 如何选择色谱条件 如何优化分离 第四章 离子交换色谱 离子对色谱 离子交换色谱 适用于离子型物质的分离和分析 4 1离子交换色谱一 原理 用离子交换剂作固定相 以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相 样品中各离子依据它们与离子交换剂的交换能力大小来进行分离的色谱方法 原理 流动相 溶质离子 离子交换剂 反离子 平衡时 平衡常数为 控制k 可以改变流动相的离子强度注 只有当溶质呈离子状态时 才能在离子交换柱上有保留 流动相p 和溶质 都是很重要的参数 二 离子交换剂阳离子交换剂 带负电荷官能团 SO3 磺酸型 COO 羧酸型 阴离子交换剂 带正电荷官能团 NH3 氨基型 NR3 季胺型 常见 硅胶为基体的键合相离子交换剂例 pH对交换容量的影响 强酸 强碱性离子交换剂 交换性能不受pH影响 交换容量恒定 弱酸性阳离子交换剂 在较高pH条件下弱碱性阴离子交换剂 在较低pH条件下发生离子交换pH与交换容量关系图 三 离子交换色谱的影响因素 流动相PH的影响例 弱酸 HA H A PH A 交换能力 tR PH A 交换能力 tR 弱碱 NH2 H NH3 PH NH3 交换能力 tR PH NH3 交换能力 tR 对分离不同PKa的酸碱是个有利因素例 流动相中反离子的形式和浓度交换平衡常数KB A 反映了溶质和交换剂的亲和力大小亲合力影响因素 a 电荷数 亲合力 b 离子的水合体积 亲合力 c 离子极化率 亲合力 对磺酸型阳离子交换树脂 一价阳离子的洗脱强度顺序 Cs Rb K NH4 Na H Li 二价阳离子的洗脱强度顺序 Ba2 Pb2 Sr2 Ca2 Cd2 Cu2 对季胺型阴离子交换树脂 阴离子的洗脱强度顺序 ClO4 I HSO4 SCN NO3 Br NO2 CN Cl BrO3 OH HCO3 H2PO4 IO3 CH3COO F 注 调节离子强度常用Na2SO4 NaNO3 不采用NaCI增加离子强度类似于增加洗脱强度 三者相互作用力关系 溶质对R 的亲合力 交换能力 tR 流动相离子对R 亲合力 洗脱能力 tR 有机溶剂影响有机溶剂 溶剂强度 洗脱能力 k P335 337 作业 思考题 21 46 51 59 60 四 离子抑制法 定义 在反相色谱中 通过调节流动相pH值 抑制组分解离 增加其在固定相上的保留 以达到分离的目的 分离对象 弱酸 弱碱性物质k 影响因素 与流动相pH值有关弱酸HA pH HA 疏水缔合 tR k pH HA 疏水缔合 tR k 弱碱A pH HA tR k pH HA tR k pH k 关系曲线图但对强酸 强碱不适合 为什么 4 2离子对色谱P333 335 定义 将一种与溶质离子电荷相反的离子 反离子 加到流动相中与溶质离子结合形成疏水性离子对 能够在两相之间进行分配 反相离子对色谱 非极性的疏水固定相 C18柱 含有反离子Y 的甲醇 水或乙腈 水作为流动相 试样离子X 进入流动相后 生成疏水性离子对X Y X 水相 Y 水相 X Y 有机相 基本原理 X 水相 Y 水相 X Y 有机相形成的离子对化合物X Y 在两相间进行分配平衡常数 溶质的容量因子k 为 容量因子随KXY和 Y 水相的增大而延长 而KXY取决于反离子和固定相的性质 则控制流动相中加入的反离子特性和浓度可以调节组分保留时间 达到提高色谱分离选择性的目的 常见 固定相 化学键合相流动相 缓冲溶液 含反离子 有机改善剂离子对试剂 阴离子分离 常用烷基铵类 十六烷基三甲胺 四丁基胺 阳离子分离 常用烷基磺酸盐 己烷磺酸钠 高氯酸盐 四 影响反相离子对色谱分离选择性因素 1 溶剂极性的影响极性 有机溶剂比例 洗脱强度 k 2 离子强度的影响水溶液中离子强度 洗脱能力 k 3 PH值的影响弱酸 PH值接近7 组分完全电离 最易形成离子对 k 最大PH X HX 固定相中离子对减少 k 一般 PH 2 7 4PH 8硅胶溶解 4 离子对试剂性质和浓度的影响离子对试剂烷基链 疏水性 缔合物k 无机盐离子对试剂 疏水性减少 缔合物k 离子对试剂浓度 10 4 10 2mol L5 温度的影响流动相粘度大 温度 柱效 思考 1 反相离子对色谱中 那些因素影响组分的保留 如何影响 2 离子交换色谱中 溶质 固定相 流动相三者间具有怎样的关系 它们是如何影响组分的保留的 第五章 体积排阻色谱法 凝胶色谱法 根据化合物分子大小和形状差别进行分离的方法分离对象 高分子化合物 生物大分子样品 蛋白质样品 固定相 凝胶 具有一定大小孔径分布 原理 按分子大小分离 小分子可以扩散到凝胶空隙中通过 出峰最慢 中等分子只能通过部分凝胶空隙 中速通过 而大分子被排斥在外 出峰最快 凝胶色谱的校正曲线 M V关系曲线 分子量越小 渗透越深 洗脱体积越大 凝胶色谱特点 a 样品峰全部在溶剂的保留时间前洗脱b 柱内的峰扩展较小c 峰较窄 有利于检测d 采用示差检测器不足 a 峰容量小b 不能分离大小相似 分子量接近的组分 固定相 1 半刚性凝胶高交联度的聚苯乙烯 孔径范围较宽 常以有机溶剂作流动相 孔径 10nm分子量103孔径10 200nm分子量50 107 2 刚性凝胶多孔硅胶 它既可用水溶性溶剂 又可用有机溶剂作流动相 可在较高压强和较高流速下操作 但易拖尾 凝胶的选择 渗透极限 可以分离的最高分子量 与孔径有关 孔径大 渗透极限大 分离范围 校正曲线的线性部分不同凝胶有不同的渗透极限和分离范围 移动相选择P321 326 339 341 a 能溶解样品b 不应造成填料太大的溶胀或收缩c 控制PH和离子强度 可消除非排除机理的影响 离子强度0 05 0 1常用磷酸盐或硫酸盐PH接近中性为宜 d 尽量降低溶剂粘度 加电介质 e 选择与样品折射率差别大的溶剂 提高灵敏度样品浓度 0 01 0 5 常用 甲苯 苯 CH2Cl2 CHCl3 CCl4 四氢呋喃 水溶液 色谱分离方法的选择 要正确地选择色谱分离方法 必须做到 了解样品的有关性质 熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围 选择色谱分离方法的主要依据 样品的分子量的大小 在水中和有机溶剂中的溶解度 极性和稳定程度 化学结构等物理 化学性质 一 分子量对于分子量较低 一般在200以下 挥发性比较好 加热又不易分解的样品 可以选择气相色谱法进行分析 分子量在200 2000的化合物 可用液固吸附 键合相色谱和离子交换色谱法 分子量高于2000 则可用排阻色谱法 二 溶解度水溶性样品最好用离子交换色谱法和离子对色谱法 微溶于水 但在酸或碱存在下能很好电离的化合物 也可用离子交换色谱法 油溶性样品或相对非极性的混合物 可用液 固色谱法 三 化学结构若样品中包含离子型或可离子化的化合物 可首先考虑用离子交换色谱 异构体的分离可用液固色谱法 同系物可用反相键合相色谱法 对于高分子聚合物 可用体积排阻色谱法 小结 a 已知结构试样 查阅文献资料 以其他色谱分离技术作参考b 分子量较大 M 2000 蛋白质 高聚物 凝胶色谱法c 分子量较小 M 2000 试样 多种溶剂中溶解度情况决定分离类型 填料 流动相由于试样组分的复杂性 还需对试样的来源 性质等作详细了解 以作选择参考 分离类型选择 应用目前已普及于几乎所有重要的分析学科领域和许多科研生产部门 高效液相色谱能较理想地分离和分析与生物医学有关的大分子和离子型物质 各种高分子化合物和不稳定化合物 例如 蛋白质 核酸 氨基酸 多糖 颜料极性类脂肪化合物 药物 染料 表面活性剂 农药 甾族化合物 多环芳烃 合成聚合物 瞟吟 维生素 除锈剂 防老剂等等 农药的分析 作业 思考题 54 55 56 57 58 第六章 实验技术和辅助实验技术 6 1定性和定量分析一 定性分析 利用保留值定性a 与标准物对照b 将标准物加入样品中c 二极管阵列检测器 联机定性 收集洗脱液后定性分析 二 定量分析 标准曲线法 外标法 是一种简便 快速的绝对定量方法 步骤 用标准样品配制成不同浓度的标准系列 在与欲测组分相同的色谱条件下 准确进样 测量各峰的峰面积或峰高 用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线 特点 适用于大量分析 色谱条件完全相同 归一化法 所有组分都出峰 并在检测器上都有信号 内标法 选取合适内标物 准确度 精密度较好 标准加入法 加入标准样品 利用加入前后峰面积变化计算 三 影响定量分析结果准确度因素 样品制备a 样品溶剂与洗脱液互溶性好b 将干扰组分尽可能分离c 含量低时必须富集回收率试验 标准物加入到已知含量被测样品中 用制备样品同样方法处理 定量测定 得回收率 回收率 测定值 样品值 加入量目的 检验被测组分在制备中是否100 定量转化 储存条件 低温 干燥 避光样品制备方法 a 溶解 超声波 离心 b 浓缩c 萃取d 预分离e 衍生化 进样技术影响因素 a 进样装置的准确度和精度b 分析人员对进样技术的熟练程度进样 六通进样阀 定量进样管3 4倍 检测器特性稳定性和线性范围直接影响定量准确性a 被测组分浓度和响应值呈线性关系b 进样量不能超出线性范围注 定量分析不宜采用梯度洗脱 基线易漂移 6 2HPLC实验技术 一 色谱柱的保养 新柱要作净化处理 平时使用 a 正式进样前 先用流动相冲平衡b 一种流动相换另一种时 需互溶 柱的储存 储存于相对惰性溶剂中 反相柱用甲醇 对复杂样品或易污染样品 应装预柱 实验结束时 当洗脱液用缓冲液 应先水冲柱 甲醇保护 二 流动相的处理 流动相的脱气原因 a 高柱压下流动相中空气 会在柱的洗脱液流中形成气泡 干扰检测器信号 b 除去氧 氧易与固定相 流动相反应 不利于柱稳定 脱气方法 a 真空脱气法b 惰性气体吹脱法c 超声波脱气法 流动相的纯化a 将溶剂通过干燥的多孔硅胶漏斗 0 45 b 在进样器之前设置预柱 将杂质吸附掉 流动相配制a 先配制再脱气 或先脱气再配制b 对含量少的溶剂必须用移液管精确量取c 如用缓冲液 浓度应尽量低些 0 001 0 01mol L 三 样品的预处理 目的 除去微粒 减少干扰杂质 微量组分浓缩 改善分离效果 仪器和色谱柱得到保护对样品预处理 达到以下要求 样品全部转化为溶液 溶液浓度低 溶剂洗脱强度低于流动相 与流动相相溶 预处理常用方法 萃取法水溶液试样 被分析物质用有机溶剂萃取常用 CHCl3 CH2Cl2 正己烷 二乙醚 苯 乙酸乙酯脂溶性非离子型化合物 杂质形成盐 萃取到水相 吸附法 a 薄层吸附 吸附剂 硅胶 氧化铝b 预柱吸附 被分析物吸附到柱上 膜过滤法 去除蛋白质 衍生化法 6 3HPLC辅助实验技术 一 化学衍生化技术 柱前衍生化 被测组分通过衍生化反应 生成衍生化产物 然后通过色谱柱进行分离 测定 优点 不受反应条件限制 允许较长反应时间 试剂过量易除去缺点 反应后易产生多种衍生化产物 给分离带来困难 柱后衍生化 样品先通过色谱柱流出的组分分别与衍生化试剂反应 衍生化产物进入检测器优点 可自动连续进行 操作简便 不会因衍生化反应给色谱分离带来困难缺点 仪器结构复杂 要求反应时间短 重现性好 柱后死体积大无论柱前 柱后 都要求 a 反应定量进行b 副反应和过量试剂不影响检测 二 柱切换技术 应用范围 分离分析极性范围很宽的多组分样品 可用梯度洗脱代替 该技术 样品富集 纯化 制备 切割柱切换阀要求 a 能承受无数次切换循环b 死体积小c 阀材料无吸附性 耐腐蚀 三 制备色谱 分析色谱 在样品分离基础上 作定性 定量分析 进样量小 制备色谱 在分离基础上 获得纯物质 进样量大 液相制备色谱仪 遇到的典型问题 获得最大制备量的途径 微量和痕量组分的分离制备 再循环技术 将含有重叠峰的组分洗脱液从检测器出口 泵 色谱柱 进行第二 三次分离 能得到良好分离效果对仪器要求 制备数mg以下 分析色谱仪 3mg为最大进样量 制备数十mg 制备型色谱仪 内径 23 4mm 流量 10ml min样品浓度 a 制备色谱 0 1 10 b 分析色谱 0 05 0 5