《噬菌体展示技术》PPT课件.ppt

噬菌体展示技术 噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型 在溶菌周期 噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的 制造厂 产生出大量的子代噬菌体颗粒 实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体 溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA上 成为它的一个组成部分 感染过程中不产生子代噬菌体颗粒 具有这种溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体 噬菌体展示技术是一种将外源肽或蛋白基因与噬菌体特定蛋白基因在其表面进行融合表达的新技术 该技术实现了表型与基因型的统一 随着噬菌体展示技术的进一步发展 其优越性被越来越多的实验室所认识 使得该技术的使用范围不断扩展 也使该技术得以不断的完善和发展 原理将编码 诱饵 蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组 并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合 重组噬菌体侵染宿主细菌后 复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒 直接用于捕获靶蛋白库中与 诱饵 相互作用的蛋白质 噬菌体展示系统的分类展示系统分为 丝状噬菌体展示系统 T7噬菌体展示系统 T4噬菌体与lamda噬菌体展示系统所展示内容包括 随机肽段 天然肽段 cDNA 抗体 抗体片段等等筛选方式包括 体外筛选和体内筛选 用抗体 受体 核酸 以及某些碳水化合物可以从噬菌体随机肽库中筛选出与之结合的肽段 因此在抗原表位分析 分子间相互识别 新型疫苗及药物的开发研究方面有广泛的应用前景 噬菌体展示技术的应用 近几年来 噬菌体展示技术成为探测蛋白空间结构 探索受体与配体之间相互作用结合位点 寻找高亲和力和生物活性的配体分子的有利工具 在蛋白分子相互识别的研究 新型疫苗的研制以及肿瘤治疗等研究领域产生了深远的影响 肽库 peptidelibrary 的应用为确定表位序列以至其构象提供了另一有力工具 噬菌体展示技术的主要优势在于它将蛋白质与其遗传信息之间提供了直接的物理联系 人们可以有效的对所需功能的克隆进行反复筛选 并随之对其进行扩增 因此 在文库筛选的过程中 特定的噬菌体克隆由于对其配体的特意亲和性而不断的得到富集 从而使相对稀少的可以结合配体的克隆能够快速 有效地从一个大文库中被筛选出来 另外 他还有以下很多显著的优点 A 高通量的淘选将抗体固定在固相载体上 加入噬菌体展示肽库 利用抗原 抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上 不能结合的噬菌体仍在溶液中 可以通过洗涤去除 再将特异结合的噬菌体洗脱下来 如此反复数轮扩增 淘选 即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来 B 可用于模拟表位的筛选利用噬菌体展示技术得到模拟表位的报道较多 Giuseppe 2001 Seshietal 2002 Ouyangetal 2003 模拟表位同样可诱发与天然表位相似的特异性免疫反应 例如利用乙肝病毒的模拟表位免疫小鼠可诱导产生高滴度的乙肝病毒抗体 C 易于纯化重组噬菌体的纯化步骤简单 不要求昂贵的试剂与设备 在一般的实验室条件下就可以完成 目前用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体为M13单链噬菌体 噬菌体展示技术的局限性1 在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化 噬菌体包装 有的展示系统还要经过跨膜分泌过程 这就大大限制了所建库的容量和分子多样性 目前 常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在10 2 不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达 因为有些蛋白质功能的实现需要折叠 转运 膜插入和络合 导致在体内筛选时需外加选择压力 3 噬菌体展示文库一旦建成 很难再进行有效的体外突变和重组 进而限制了文库中分子遗传的多样性 4 由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达 所以 一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子 很难得到有效表达和展示