环氧乙烷残留量气相色谱法分析.ppt

技术中心实验室2018 06 环氧乙烷残留量分析方法 环氧乙烷 气相色谱的基本概念 气相色谱的结构 EO的测试 气相色谱的维护 其他测试 理化性质 最简单的环醚无色气体沸点 10 4 易爆 易挥发 有醚味 1 1环氧乙烷的综述 环氧乙烷对人体的危害 1 急 慢性毒性 2 三致作用及生殖毒性 3 急性中毒与局部刺激 4 神经系统损害与慢性毒性 5 致癌作用 6 生殖毒性 灭菌 EO具有顽强的扩散和穿透能力 对细菌芽孢 真菌和病毒等各种微生物均有灭杀作用 属于广谱灭菌剂 机理 烷基化反应 1 1环氧乙烷的综述 残留物 1 EOEthyleneOxide环氧乙烷2 ECHethylenechlorohydrin氯乙醇3 EGEthyleneGlycol乙二醇 一种刺激体表 具有急性毒性 并且在中毒剂量通过皮肤快速吸收的易燃性液体 轻微的致突变性 具有产生胎儿毒性的潜能 动物致癌试验 阴性 ISO10993 7 2008附录I EG无遗传毒性 未显示任何潜在的致癌性 多数材料中EO转化为EG不明显 且EG允许限量明显高于EO ECH 棉花 胶原 参照标准 ISO10993 7 2008 医疗器械环氧乙烷的接触量限度 1 2环氧乙烷限量 1 3环氧乙烷分析方法 比色分析法 环氧乙烷在酸性条件下水解生成乙二醇 乙二醇经高碘酸氧化生成甲醛 甲醛与品红 亚硫酸试液反应生成产生紫红色化合物 通过比色分析法可求得环氧乙烷含量 气相色谱法 在一定温度下 用萃取剂萃取样品中所含环氧乙烷 EO 用顶空气相色谱法测定环氧乙烷含量 1 4环氧乙烷 浸提方法 浸提方法 模拟使用浸提 极限浸提 定义 用水浸提来模拟产品使用 通过评价患者或使用者在日常使用器械中所接触到的残留物水平 a 浸提介质 水b 浸提温度 整个或部分与人体接触的器械在37 浸提 不直接与人体接触的器械在 25 2 浸提 c 浸提时间 应考虑在推荐或预期使用最为严格的时间条件下进行 但不短于1h d 浸渍表面 器械与药液或血液接触的表面 短期接触长期接触 定义 随后的浸提至浸提液中EO或ECH的量小于首次浸提液中10 检出量的浸提 或浸提到测得的累积残留量无显著性增加 持久接触 包括热极限浸提法和溶剂极限浸提法 通过分析有代表性的 最坏情况 经动力学研究来掌握一族相似的产品 1 5影响环氧乙烷残留量的因素 温度 装载密度和排列 气流 时间 因素 材料组成 涤纶 聚碳酸酯吸附量大 包装材料 包装密度 运输容器的密度 浓度 作用时间 温度 循环类型 湿度 抽真空度与换气次数 产品密度 通风 灭菌循环 包装 组合包 选择残留量最大的作为代表如 导管 纱布 吸液材料 手术衣袖口 1 5影响环氧乙烷残留量的因素 组合包 手术衣袖口 分配系数在一定温度下 组分在两相间分配达到平衡时的浓度 g mL 比 用K表示 分配比k 质量比 又叫容量因子或容量比 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数 随分离柱温度 柱压的改变而变化 分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数 数值越大 该组分的保留时间越长 2 1色谱的基本概念 分配系数 2 1色谱的基本概念 分配系数 分配比与分配系数的关系 式中 为相比 流动相体积Vm与固定相体积VS之比 分配比k与保留时间tR的关系 k的实验求解 2 2色谱的基本概念 1 基线无试样通过检测器时 检测到的信号即为基线 2 保留值 时间或体积 保留时间 tR 组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间 死时间 tM 不与固定相作用的气体 如空气 的保留时间调整保留时间 tR tR tR tM 2 2色谱的基本概念 3 相对保留值r21 组分2与组分1调整保留值之比 r21 t R2 t R1 V R2 V R1 相对保留值只与柱温和固定相性质有关 与其他色谱操作条件无关 它表示了固定相对这两种组分的选择性 r21 t R2 t R1 K2 K1 k1 k2 2 2色谱的基本概念 色谱峰为高斯正态分布时 色谱流出曲线为 用来衡量色谱峰区域宽度的参数 有三种表示方法 1 标准偏差 即0 607倍峰高处色谱峰宽度的一半 2 半峰宽 Y1 2 色谱峰高一半处的宽度Y1 2 2 354 3 峰底宽 Y Y 4 色谱柱效参数 2 3色谱的基本概念 理论 两种色谱理论塔板理论 热力学因素速率理论 动力学因素 塔板理论的假设 1 在每一个塔板上 可以迅速建立分配平衡 2 将流动相看作成脉动 间歇 过程 3 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略 4 每次分配的分配系数相同 2 3色谱的基本概念 塔板理论 色谱柱长 L 塔板高度 H 色谱柱的理论塔板数 n 则三者的关系为 n L H理论塔板数与色谱参数之间的关系为 组分在tM时间内不参与柱内分配 需引入有效塔板数和有效塔板高度 Y 柱效参数 单位柱长的塔板数越多 表明柱效越高 Y 2 3色谱的基本概念 塔板理论 1 提出了计算和评价色谱柱效的参数和方法 2 柱效不能表示被分离组分的实际分离效果 当两组分的分配系数K相同时 无论该色谱柱的塔板数多大 都无法分离 3 无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果 也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径 塔板理论的特点和不足 2020 3 29 2 4色谱的基本概念 速率理论 用速率方程重新定义塔板高度 并提出影响柱效的动力学因素 涡流扩散 分子扩散 传质阻力速率方程 也称范 弟姆特方程式 H A B u C uH 理论塔板高度 u 载气的线速度 cm s A涡流扩散项B u分子扩散项Cu传质阻力项 2 4色谱的基本概念 速率理论 涡流扩散项 A 2 dpdp 固定相的平均颗粒直径 固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小dp 填充的越均匀 A H 柱效n 色谱峰变宽现象减轻 色谱峰较窄 2 4色谱的基本概念 速率理论 分子扩散项 B 2 Dg 弯曲因子 Dg 组分在气相中的扩散系数 cm2 s 1 与组分性质 流速 滞留时间 流动相性质 柱温等因素有关 传质阻力项 2 4色谱的基本概念 速率理论 k为容量因子 Dg DL为扩散系数 减小担体粒度 选择小分子量的气体作载气 可降低传质阻力 流动相传质阻力Cg固定传质阻力CLC Cg CL 2 5色谱的基本概念 分离度 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度 即柱效为多大时 相邻两组份能够被完全分离 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响 保留值之差 色谱过程的热力学因素 区域宽度 色谱过程的动力学因素 色谱分离中的四种情况如图所示 柱效高 K 分配系数 较大 完全分离 K不是很大 峰较窄 柱效高 基本分离 峰宽 柱效较低 K较大 但分离的不好 K小 柱效低 分离效果更差 2 5色谱的基本概念 分离度 分离度的表达式 R 0 8 两峰的分离程度可达89 R 1 分离程度98 R 1 5 达99 7 相邻两峰完全分离的标准 2 5色谱的基本概念 分离度 影响分离度的因素 理论塔板数n增加柱效 可提高分离度r21 或 选择因子 增大r21是提高分离度的最有效方法 容量因子 分配比 2 5色谱的基本概念 分离度 k影响峰位 n影响峰宽窄 影响两峰间距 2 6色谱的基本概念 分离条件的优化 载气及其流速 H A B u C u 最佳流速uopt B C 1 2 柱温柱温 分离度 分析时间 综合考虑复杂 沸程宽的试样 采用程序升温 柱长和柱内径满足分离目的的前提下 尽可能选用较短的柱 载体粒度影响柱效 进样方式和进样量 2 7色谱的基本概念 用回收率表示 至少3个浓度点9个结果 术语 检出限 一般认为 色谱图上平直基线部分的噪声峰高RN 3倍RN对应的量就是检出限 基线漂移在最初基线的5 以内 至少5个浓度点 最小相关性宜为0 95 ISO10993 2008 要求0 99以上 准确度 相关性 基线 3 1气相色谱 结构 气相色谱法系采用气体为流动相 载气 流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法 物质或其衍生物气化后 被载气带入色谱柱进行分离 各组分先后进入检测器 用记录仪 积分仪或数据处理系统记录色谱信号 采用溶液直接进样时 进样口温度应高于柱温30 50 柱温箱稳定性要求 1 波动0 1 h 火焰离子化检测器 FID 痕量有机物热导检测器 TCD 水 气体混合物的分析电子捕获检测器 ECD 含卤素的化合物NPD FPD MS 检测器温度一般应高于柱温 并不低于150 以免水汽凝结 通常为250 350 色谱柱 填充柱或毛细管柱 230 老化5h 载气系统包括气源 气体净化 气体流速控和测量5个9 隔垫衬管 3 2气相色谱 操作 毛细管进样系统 InertCap6240 32mmx30mx3 00 m 上海舜宇GC1120 4 1气相色谱法 定量法 定量法 归一法适用于试样中各组分都能流出色谱柱 并在色谱图上显示色谱峰 全部出峰 外标法精密量取对照品 配制成溶液 注入仪器 记录色谱图对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积 或峰高 按下式计算含量 Cx CR Ax AR 自动进样 内标法精密取对照品和内标物质 分别配制成溶液 精密取各溶液配成校正因子测定的对照溶液 测量对照品和内标物质的峰面积或者峰高 按下式计算校正因子 f As CR AR Cs再取各项中含有内标物质的供试品溶液 测量峰面积 按下式计算含量 Cx f Ax C s A s 例子 EO ECH 例子 乙醇 正丙醇 甲醇 正丁醇 EO 氧化丙烯 内标物4个注意点 相近相似 试样中不存在内标物 且完全分离 纯物质或已知含量 互溶 不可逆 不能全部出峰 标准贮备液 测试样品 绘标准曲线 参考标准 ISO10993 7 2008 GB T14233 1 2008 4 2EO的测试 计算结果 4 3标准曲线 EO 1 标准储备液的配制取外部干燥的50mL容量瓶 加入30mL水 称重 记a 用冷却的注射器加入0 2mL环氧乙烷 轻轻摇晃后 盖好瓶盖 称重 记b 前后质量差即为溶液中所含环氧乙烷的质量 加水至刻度线 配成储备液 该浓度为C1 b a CEO 103 50mg mL 2 稀释10倍为C2后配置成标样点3 加热每个标样取5mL液体 于60 下加入40min4 测试并绘标准曲线 5 举例a 61 6839gb 61 8183gC1 61 8183 61 6839 x99 5 x103 50 2 67456mg mL 2674 56 g mL稀释10倍 C2 267 456 g mL取8个100mL容量瓶 配置标样点 4 4标准曲线 EO 4 4测试样品 1 制样将样品透析包装打开 选取易于拆卸 剪取及不易环氧乙烷解析部位 将样品剪成5mm碎块 取1 00g 置于20mL顶空瓶 加水5 0mL 密封 注意 a 做好准备工作b 组合包中每款产品都检 以 结果最坏的 作为组合包的测试结果c 稀释合适的倍数2 加热样品于60 下浸提40min 极限浸提法 3 测试4 记录导入校准表 查看结果 热极限浸提法 绝对含量WEO 5cm1 m 10 3 mg m1 单位产品质量 m 称样量相对含量CEO 5c m g g 4 4测试样品 4 4样品的处理 1 样品的保存 注 验证时 空白样品 4 4样品的处理 2 顶空瓶的处理测试完的顶空瓶 剪开瓶盖 倒出样品 在自来水下冲洗后 放在盆中 加入肥皂水 于通风橱下浸泡1 2天 捞出清洗干净 在120 下干燥2 3h 注 验证时 空白样品 五 气相色谱 维护 a 新的柱子主要目的 去除键和不够稳定的固定相 让新柱子性能更稳定 b 多次测试的柱子或测了残留大样品的柱子主要目的 去残留 T老化 T方法Max T耐受Max 2 老化的第一个重点 老化的最高温度 极性强 膜厚大的柱子通常耐受温度比较低 老化前 需仔细查阅色谱柱包装盒或说明书 5 1气相色谱 维护 色谱柱的老化 5 1气相色谱 维护 色谱柱的老化 老化失败最常见的原因a 氧气的存在高温下氧气是破坏化学键的好手 而色谱柱里的固定相一旦破坏 彼此间的键键链会破坏 固定相不能再 稳定 固定在色谱柱中 造成大量柱流失 柱效大幅下降 处理 1 把色谱柱末端伸入溶剂中 观察是否有连续的泡沫 查漏 2 升温前 先通15min氮气3 确保其它接头 正确安装 c 已使用过的柱子先分析样品成分 若是在老化温度下也不能被完全气化的成分 如蛋白质 胶状物 在老化前 应先进行色谱柱的维护换衬管 色谱柱柱头切割 b 新柱子老化 最好不接检测器FID检测器 可不连检测器 不点火 不开空气和氢气 5 2气相色谱 维护 3 4 1气体FID 氢气为燃气 空气为助燃气纯度填充柱 99 99 氮气作为载体毛细管分析 99 999 氮气作为载气氢气 安全原因氦气 灵敏度高 基线噪声非常小 成本过高定期检查去除来自空气压缩机的空气水分的硅胶和除去有机物的分子筛等极性强的毛细管柱耐氧化性差 容易因氧化等而变化 因此 尽量装配氧气捕集器除氧 氧气捕集器须定期用氢还原进行再生 来自空气压缩机的空气不是经常流量一定 流量变动会影响基线 因此 在流路途中增加硅胶管和用于控制流量的波纹管阀 使流量稳定 3 4 2柱柱的使用温度尽量比柱的耐热温度低除去载气中的氧 特别是使用极性柱时 使用高纯度气体 气瓶更换时不要混入空气氧气捕集器装在GC前不要使难挥发的成分进入柱内充分做好试样的预处理使用柱衬管和石英棉安短的一次性使用的前置柱 3 4 3FID检测器柱子老化时 不要把柱子与检测器连接 以免检测器被污染 上海舜宇GC1120的色谱柱最高温度为230 各操作温度未平衡之前将氢气及空气源关闭 以防止检测器内积水 点火时 不要使按钮按下时的时间过长 以免损坏点火圈 仪器开机后 应先通过载气再升温 待FID检测器温度超过100 时方能点火 6 1其他 酒精的测试 1 比重法适用于仅含乙醇和水的溶液原理 酒精比重计放入样品溶液中 比重计下按放手 当其上浮静止且溶液无气泡时 读取液面处刻度 即为乙醇含量 3 比色法 紫外 可见分光光度法参考标准 中国药典2015版 第三部 P4623201乙醇残留量测定法原理 乙醇在饱和碳酸钠溶液中加热逸出 被重铬酸钾 硫酸溶液吸收后呈黄绿色至绿色 用比色法测定血液制品中乙醇残留量 波长650nm 4 气相色谱法 毛细管柱法加校正因子内标法 参考标准 中国药典2010版附录 M GB26373 2010乙醇消毒剂卫生标准附录A柱温 程序升温 50 保持7分钟 然后以每分钟10 的速率升温至110 进样口温度 190 检测器 FID 温度220 分流进样 载气 N2 内标物质 正丙醇理论板数按正丙醇峰计算应不低于8000 乙醇和正丙醇两峰的分离度应大于2 0 2 蒸馏法 6 2其他 甲醇的测试 1 变色酸比色法原理 甲醇在磷酸溶液中 被高锰酸钾氧化成甲醛 用偏重亚硫酸钠除去过量的高锰酸钾 甲醛与变色酸在浓硫酸存在下 先缩合 随之氧化 生成对醌结构的蓝紫色化合物 与标准系列比较定量 分光光度计波长570nm2 品红 亚硫酸比色法波长595nm 3 气相色谱法 毛细管柱法加校正因子内标法 PEG交联石英毛细管柱柱温 程序升温 70 保持3分钟 然后以每分钟5 的速率升温至100 进样口温度 200 检测器 FID 温度200 分流比20 1 100 1 N2 0 5mL min 氢气30mL min 空气300mL min 内标物质 正丁醇 GB T394 2 2008酒精通用分析方法 谢谢大家