TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法tunel完成.ppt

TUNEL TdT mediateddUTPnickendlabeling 法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色 能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征 可用于石蜡包埋组织切片 冰冻组织切片 培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定 并可检测出极少量的凋亡细胞 灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高 因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用 TdT介导的dUTP缺口末端标记技术 TUNEL TUNEL TUNEL的原理 TUNEL的操作步骤 结果及注意事项 主要试剂 1 缓冲液 LabelingBuffer 用于维持一定的反应条件 含有以下成分 500mmol L二甲胂酸钾 pH7 210mmol LCoCl2 氯化钴 1mmol LDTT 二硫苏糖醇 2 末端脱氧核糖核酸转移酶 TdT 催化3 OH末端dUTP反应的关键酶3 荧光素 dUTP TdT的底物和本实验的标记物4 蛋白酶K 消化组织 增加细胞通透性 凋亡细胞的特征是 内源性核酸内切酶被激活 细胞自身的染色质DNA被切割 出现单链或双链缺口 并产生与DNA断点数目相同的3 OH末端 末端脱氧核糖核酸转移酶 TerminaldeoxynucleotidylTransferaseTdT 能将脱氧核糖核苷酸连接到DNA的3 末端 TUNEL的原理是 用荧光素 fluorescein 标记的脱氧核糖核苷酸 在TdT的作用下连接到凋亡细胞中断裂DNA的3 OH末端 用荧光显微镜即可观察结果 在此基础上连接辣根过氧化酶标记的荧光素抗体 可进一步放大检测信号 并且普通显微镜观察实验结果 由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂 因而没有3 OH形成 很少能够被染色 TUNEL原理 标本处理 实验步骤 实验流程 结果 注意事项 极少数细胞凋亡时没有DNA断裂或DNA裂解不完全 此时不适用TUNEL法检测 进而产生假阴性结果 在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性 在高度增殖 代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断 从而引起假阳性结果 在需要严格判断细胞凋亡的情况下 最好同时检测多个凋亡指标