体外代谢清除率模型用于药物肝代谢过程的研究.doc

体外代谢清除率模型用于预测药物肝代谢过程的研究 黄峰 中药学 2110948107摘 要：本文主要就计算体外代谢清除率的理论与预测模型做一综述，以期使体内药物代谢过程的检测更加准确，并在此基础上可以预测创新药物在体内可能进行的代谢过程，确定其是否适合进行进一步研究开发，为筛选新药提供新的思路。关键词：代谢清除率；药物代谢动力学；体外模型前言药物发现与开发的目标是找出并确定具有药理活性的新化学实体。在过去的几十年里, 药物发现与开发一般方法是在进行药理活性检测后,再对新化学实体进行临床前的动物实验和临床人体试验1。近些年随着组合化学和高通量活性筛选技术的发展,已经使人们能够在一周之内筛选的化合物超过10万个2,从而发现大量具有药理活性的化合物。然而一个化合物最终成为能够上市的药物,必须具备良好的类药属性,即：药效活性、安全性、药代属性和适宜制剂的理化性质。其中,药代属性主要是指化合物能够通过不同生物膜到达作用部位的能力,包括口服生物利用度的高低；以及化合物能否在体内保持一定的浓度水平；与靶受体维持足够时间的结合以产生具有临床意义的药理作用等。药代研究是一项非常复杂的费时费力的工作，是目前加速药物发现阶段研究速度的瓶颈。此外,要在前期阶段了解化合物的药代动力学特征,还有一个重要的原因是考虑开发新药的经济成本,一个新药上市需要投入大量的资金,大约在1030亿美元之间3,其间被淘汰化合物的数量也是惊人的,因而可以说大量的资金是投入到那些失败了的化合物。因此,任何能够尽早地揭示化合物的药代动力学特征的研究方式对于降低在高成本的药物开发阶段的失败率是非常有价值的4。肝脏是药物的主要代谢器官,富含参与药物I相代谢和II相代谢的混合功能氧化酶系统,其中90%药物主要是由细胞色素P450酶(cytochromeP-450,CYPs)参与进行生物转化。当前,人肝细胞3, 4、肝切片5、cDNA表达的基因重组肝药酶系6及人肝微粒体7等体外模型已被成功用于对体内肝代谢研究的预测。体外代谢研究可排除体内因素干扰,直接观察酶对底物的选择性代谢,为整体试验提供可靠的理论依据。通过体外数据可估算药物的体内代谢清除率,并可以利用这一药动学参数进一步求算出生物利用度和半衰期,而以上参数对确定其体内药理、毒理作用及患者的顺应性等方面非常重要8,并对临床上确定第1次给药剂量和给药频率具有十分重要的参考价值10。因此,以肝脏为基础的体外代谢预测模型近年来在药物代谢研究中得到广泛应用,本文对这一领域的研究作以下概述。1 药物代谢清除率临床前预测的理论基础利用化合物体外代谢数据预测体内清除率的一系列理论,已由Iwatsubo等11作了详尽地描述。其预测理论的前提是假设肝代谢是药物的主要清除途径,胆汁分泌及非肝脏清除机制,如肝外代谢和肾分泌等均可忽略。通过体外代谢研究得到一个重要的参数:固有清除率( intrinsic clearance,CLint),再借助于相关转换因子(如比放系数)和体外肝模型,预测估算得到体内的清除率12。一般过程如下：按照酶动力学理论,采用米曼氏方程(Michaelis-Menten equation)可以描述游离药物的代谢速率。CLint由V0/S相比而来,表示药物的代谢速率与酶底物浓度(S)的关系。当药物浓度远远小于Km值时,固有清除率可以表示为:CLint = Vmax / Km （式1-1）Vmax为最大反应速度；Km为米氏常数，表示酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，使用该方法获得CLint值的前提条件是：所有代谢产物应明确； V0保持恒定时进行测量；药物浓度尚未达到饱和,而且应能代表大部分游离药物的浓度。然而实验前这些条件往往是未知的,目前所得到的CLint值也是代表所有与母药发生作用的酶所体现出的加和值。然而,在多数情况下,特别是创新药物研究的早期阶段,由于代谢物并不十分清楚,因此,也可以采用另一种方法进行求算,即引入药物的半衰期(T1/2)13。同前,假设S Km,有: CLint =0.693V/ T1/2 (式1-2)在得到固有清除率后，通过比放系数(scaling factor, SF)可将体外测得CLint转换为整个肝脏的清除率。SF比放系数即是一个转换因子, 可看作是酶动力学和药动学参数间的桥梁。如可代表单位重量的肝脏所含微粒体蛋白的量或肝细胞的数目。在肝微粒体实验中, SF常采用的值为每克肝含45 mg微粒体蛋白(大鼠和人)14。2 预测体内药物代谢清除率的数学模型肝脏模型可将体外代谢清除率数据用于肝清除率的计算。可用于体内清除率预测的模型很多,其中常用的模型有充分搅拌模型(well-stirred model)、平行管模型(parrallel tubemodel)和散射模型(dispersion model)15, 16。充分搅拌模型也称静脉平衡模型( venous equilibrium model),即假定组织静脉血中药物浓度与肝组织中药物浓度瞬间达到动态平衡,血管中游离药物浓度与肝细胞内的药物浓度相等,二者处于一种平衡状态。平行管模型或称窦管灌注模型(paralleled tube model),即假定药物沿窦管壁消除,窦管和肝细胞中药物浓度由动脉端向静脉方向逐渐降低。散射模型的数学表达式相对上述两种模型的公式较复杂,但更接近于生理状态17。一般而言,对于低清除率药物,这3种模型预测结果差异较小。但当肝提取率达到0.17时,肝模型之间的差别开始明显,而对于高提取率的药物(肝清除率0.19),模型之间的差别非常明显。而3种模型相比,散射模型能给出较好的拟合结果18。3药物代谢清除率预测的准确度考察Iwatsubo等15对25种不同化合物的体内、体外CLint值进行比较发现, 50%的预测值/实测值在3倍误差范围之内,而70%的结果在5倍误差范围内。尽管很多人认为他们都获得了很好的体内-体外相关性,但事实上他们有1/3的数据误差超过5倍。预测成功与否受主观性影响很大。由于没有统一的判断原则,所以一般是以2倍误差范围作为可接受的评定标准17, 19, 20。造成体外、体内预测值相差较远的因素较多，其中两个很重要的因素是蛋白结合率和比方系数的选择。3. 1蛋白结合率的影响Obach等16对14种化合物的体内、体外清除率进行比较,采用以下公式求算平均方差,从而减少偏差较大的数据对最终结果的影响。 （式3-1）该小组通过研究血浆蛋白结合的影响发现,当不考虑药物血浆蛋白结合率,即不引入fub值对结果进行校正时,预测结果均好于采用血浆蛋白结合率校正者。推测因为这些亲脂性的碱性化合物在体外孵育时与肝微粒体蛋白也呈现出高结合,而使与血浆蛋白结合的影响作用几乎抵消。Obach21进一步深入研究上述两种蛋白对实验结果的影响;采用体外孵育肝微粒体酶,测定降解半衰期的方法,对29种不同理化性质的化合物进行了人体清除率的预测。结果表明,对于碱性和中性化合物,当两种蛋白(血浆蛋白和肝微粒体蛋白)结合均不考虑和都考虑时,预测结果良好,多数在实测值的2倍误差内;但只考虑血浆蛋白结合时,预测结果很不理想。而对于酸性化合物,上述两种蛋白结合均不予考虑则导致不理想的预测结果。作者认为对酸性药物清除率的准确预测相对较难,并建议将两种蛋白结合的影响均考虑时,通常能获得较好的体内-体外相关性。因此,对不同化学性质药物的肝清除率进行预测时,蛋白结合也是重要的影响因素之一。Shibata等22设计了一种新的方法,可忽略药物与蛋白及组织的结合。该方法是将游离的大鼠肝细胞混悬于血清中而代替标准的培养液来进行孵育,最后直接测定CLint。采用该简化方法对18种主要通过肝代谢的化合物进行预测,其预测值与大鼠的实测值基本一致。而能否将这种方法用于人体清除率的预测,并得到较好的结果,还需进一步深入研究。3.2 比放系数的选择体内体外固有清除率的比放系数的选择也影响到预测的准确度。体外试验Clint in vitro的结果通常用mL/(minmg蛋白)或mL/(min细胞)表示,采用生理参数比放,换算成相对应的体内清除率Clint in vivo,用mL/(ming肝)或mL/(minkg体重)表示。在实验结果校正中,还需要考虑不同种属间体外体内比放值的影响,此时比放值由Clint in vivo/Clint in vitro获得。Naritomi等23分别用大鼠、犬和人肝微粒体察FK1052、FK480、佐尔吡啶、奥美拉唑、尼卡地平、尼伐地平、地西泮和地尔硫等8种模型化合物的体内体外清除率的相关性。该实验中各取1molL-1的不同药物与肝微粒体温孵,经过一定时间,对介质中药物浓度进行测定,求得各化合物的体外清除率。选用一定的生理参数（肝微粒体蛋白mg每克肝重）,大鼠: 44.8,犬: 77.9,人: 48.8进行比放,再采用充分搅拌模型、平行管模型和散射模型求算体内清除率。试验结果说明,用充分搅拌模型,大部分药物的体内外差别显著,只有地西泮和尼卡地平结果较为一致;用平行管模型和散射模型推算时,除地尔硫卓和地西泮预测结果较好外,其他药物的差别较大。不过当预测值用动物的比放系数进行校正后,上述3种模型均能给出较好的预测结果。文中建议校正公式为:CLint vivo/CLint vitro=SFanimal （3-2）Ito等24对33种药物进行肝清除率的预测,分别采用生理比放系数、经验比放系数及药物专属生理比放系数将体外数据比放获得在体结果。研究表明,当使用后两个比放系数时误差明显减少,而选用经验比放系数由于不需要其他临床前数据而更为简便。4小结随着药物代谢清除率预测这一研究领域的不断发展,对主要由肝代谢消除的药物进行其体内清除率的预测越来越准确(2倍误差范围内)。现今研究的重点多不仅集中在不同体外系统如肝细胞4、肝切片、cDNA表达的基因重组肝药酶系和肝微粒体的选择和条件优化等方面,而且对这些体外系统的优点进行比较9。例如，在条件优化方面，三明治培养法中的人肝细胞可使CYP酶活性, II相代谢活力足以维持数天,并可预测酶诱导产生的药物间相互作用。同时,肝代谢相关的转运体也能很好地保存于三明治培养液中。在体外系统的选择上，还有研究者应用表达灵长类CYP的杆状病毒群充当了啮齿类动物和人类数据间的桥梁。此外,研究的进展还体现在比放系数的正确使用,目标化合物浓度的精确测量和肝代谢模型的精准选择等方面。已有人讨论了从肝细胞清除率到核受体激活的测定,以及这些信息拓展到体内的可能性。在检测技术上,一种新型的稳定同位素捕捉法和中性分子丢失(neutral-loss)质谱方法增加了代谢物检测的可靠性和灵敏度。近年来,微透析技术的出现可实现在体连续取样,在阐明药物转运和作用机制、减少药物传递系统研究所需要的动物数量和实验次数等方面具有重要意义。目前,采用体外数据对人体内代谢清除率的临床前预测尚处于探索和研究阶段,因为预测过程中有许多因素可能影响预测值的准确性。但随着这门学科的发展,将预测过程中每一环节新的发现进行合理的组合,产生出改进的预测模型,并用以较精确地描述创新药物的体内代谢行为,也将成为可能。因此,借助体外试验数据对人体的主要药动学参数进行初步预测,对尽早明确药物的开发应用价值、消除盲目性、降低市场开发的风险性、从而提高新药研发的效率有着十分重要的意义和广阔的应用前景。参考文献1 Borchardt RT. 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