酶免疫测试(EIA)技术.ppt

酶免疫测试 EIA 技术 翁锡全 广州体育学院 酶免疫分析技术 enzymeimmunoassay EIA 是继荧光免疫技术和放射免疫技术之后建立的一种非放射性免疫技术 是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合 发展建立的一种非放射性标记的免疫性标记分析方法 酶免疫分析系统则属于开放式的 符合标准的各种品牌的ELISA试剂盒均可应用 且有灵敏度高 特异性强 酶免疫试剂的性质比较稳定 操作方法简便 快速 无放射性污染以及应用范围广等很多优点 酶免疫分析技术 非均相酶免疫分析 均相酶免疫分析 非均相液相酶免疫分析 非均相固相酶免疫分析 以聚苯乙烯制品作为载体的酶联免疫吸附实验 ELISA 一 酶免疫测试 EIA 技术分类 二 ELISA技术方法与原理 1 ELISA特点 在固相表面组装免疫活性物质形成 免疫吸附剂 酶标记免疫活性物质 进行信号放大 有二步温育反应二次洗涤过程 灵敏度特异性相对较高 2 ELISA局限性 只能检测到ng水平 精密度差 批内CV15 20 线性范围窄 一个数量级 3 根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方法 双抗体 原 夹心法 间接法 竞争法 ELISA测试原理 1 将链霉亲合素包被的聚苯乙烯塑料试管安置固定 2 将生物素标记的特异性抗体和待测抗原加入链霉亲合素包被小管内 经温育 生物素和亲和素发生连接 待测抗原和特异性抗体发生结合 形成固相包被亲合素 生物素 特异性抗体 待测抗原复合物 然后进行洗涤 除去未结合的抗原和生物素标记抗体 3 加入辣根过氧化物酶 HRP 标记的特异性抗体 酶标抗体 经温育形成固相包被链酶亲合素 生物素 特异性抗体 待测抗原 酶标抗体复合物 再次进行洗涤 除去多余的酶标抗体 4 加入底物ABTS和H2O2 经温育 ABTS在辣根过氧化物酶的作用下显色 然后经波长450nm的光度计测定获得A值 从标准曲线上计算出待测抗原的含量 三 自动化酶标仪基本工作原理 光源光路微孔板触摸屏电源单A D转换程控放大器多路开关光电检测显示器片打印机步进电机驱动步进电机送样机构电源机图2工作原理方框图 电源 四 ELISA操作步 1 试剂的准备 2 加样 3 保温使用恒温水箱使用保温箱 4 洗涤 5 比色 五 ELISA质量控制 一 的测试前标本的采集和保存 1 可作标本广泛 体液 如血清 血浆 各种积液 分泌物 如唾液 和排泻物 如粪便 尿液 均可 2 标本采集时应尽量避免溶血 否则造成假阳性 长菌的标本同样的道理易产生假阳性 3 抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性 建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂 4 标本保存 血清置4 冰箱5天内完成测试 一周以上则要 20 冰冻保存 融解时应上下颠倒充分混匀 5 ELISA的灵敏度 1ng ml水平上 标本间的污染要尽量避免 尤其不应与生化试验用同一管标本 最起码应先做免疫后做生化 二 仪器质控 1 移液器 ELISA加样量小 5 100 l 其准确性直接影响实验结果 利用称重法检查 一般应在 10 以内 2 水浴箱 经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中 或温箱内 实测温度是否一致 允许有 1 的误差 3 洗板机 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul 人工扣板时 垫纸不湿 定期检查管孔是否堵塞 4 酶标仪 经常维护其光学部分 防止滤光片霉变 定期检测校正 使其保持良好的工作性能 三 分析中质控 1 加样 2 温育 3 洗涤 4 显色 5 酶标仪判读结果 六 ELISA操作注意事项 1 测试之前 冰箱内试剂一定要复温 至室温 并检查是否已经变质 同时用双蒸水稀释浓缩的洗涤液和稀释液 若用不合格的蒸馏水则可使空白值增高 2 微量加液器应注意保养并定期校正 否则结果误差较大 同时加样时不可出现气泡 以免反应物间不能充分混匀反应 3 温育时要力求受热均匀 同时避免液体蒸发 4 洗涤时力求次数足够 且避免形成气泡 否则洗涤不完全 5 比色时反应管内不能留有气泡 管底不能存有水滴 否则出现较大误差 七 影响ELLSA测试结果常见问题原因及解决方法 1 选择试剂2 加样3 孵育4 洗板5 显色6 终止7 读板 八 RT 2100C型多功能酶标仪仪器特点 1 RT 2100C可广泛应用于传染病 肿瘤标志物 血液病 艾滋病 内分泌障碍测定等临床论断领域 2 大屏幕汉化界面 利用触摸屏和笔作为输入方式 极大地方便了用户的操作输入 3 100个可编程的检验项目 4 多种定量 定性计算方法5 96孔可视化布板 空白位 对照位 样本位 标准品位任意设置 同一板上可同时进行最多12个项目的测试 6 8通道检测迅速准确 5秒 板 测试前的震动混匀功能 7 大容量历史数据保存 最多可保存500个项目 1000个病人 10000条样本记录 8 形式多样的综合中文报告输出 支持多种品牌系列的外置打印机 9 强大的网络功能 可与医院内部计算机网络 质量监测中心及雷杜用户服务中心联网 为工作带来极大的便捷 10 配合使用雷杜酶标实验室管理系统 可以在联网计算机上进行数据管理和分析 11 辅助管理功能 内置科室数据库 医生数据库和系统日志数据库 九 RT 2100C型多功能酶标仪常用测试项目 1 肝炎类 甲肝抗体IgM 乙肝两对半 丙 丁 戊 庚性肝炎抗体等 2 传染病类 爱滋病 衣原体 肺炎支原体 腺病毒 幽门螺旋杆菌 腮腺炎 麻疹 水痘 百日咳杆菌 流行性出血热 狂犬病等 3 肿瘤标志物类 卵巢癌 乳腺癌 胃肠道癌 癌胚抗原 甲胎蛋白 膀胱癌 铁蛋白等 4 内分泌类 T3 T4 促卵泡生成素 FSH 黄体生成素 LH 泌乳素 PRL 人绒毛促性腺激素 HCG 睾酮 TESTO 孕酮 PROG 雌二醇 E2 雌三醇 E3 生长素 HGH 促甲状腺素 TSH 皮质醇或皮质酮 C 促红细胞生成素 EPO 等 5 自身抗体类 ENA全套6项筛选 抗核抗体 抗Sm抗体 抗精子抗体 抗双链 单链DNA 红斑狼疮筛选等 6 Torch类 病毒感染类 弓形虫 巨细胞病毒 风疹病毒 单纯疱疹病毒等 7 细胞因子类 白细胞介素 可溶性CD抗原 十 RT 2100C型酶标仪基本操作步骤 1 开机 待机器自行检测稳定 2 项目设置 RT 2100C所有项目均由用户自行定义 最多允许设置100个项目 用户已经设置的项目均在窗口中列表显示 关机时自动保存 3 样品测试 4 综合报告 实验操作项目 血清睾酮的定量测定