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致病菌细胞的近红外光谱鉴别方法研究食品与生物工程学院 荣宗有指导教师 刘建学摘要致病菌,即能够导致人类疾病或危害人类健康的细菌。致病菌污染食品可导致食物中毒与食源性感染，是食品安全的重大隐患。近红外光谱技术(NIRS)是一种高效快速的现代分析技术,是近年来发展最快的检测技术之一，具有无损、快速、高效、方便和环保的特点。本文以沙门氏菌和单增李斯特菌为代表，采用平板划线法对沙门氏菌和单增李斯特菌的分离培养进行研究。结果表明，用亚硫酸铋琼脂（BS）培养基、改良的MC Bride琼脂（MMA）培养基可将沙门氏菌、单增李斯特菌从杂菌中很好的分离开来；用光电比浊法，对沙门氏菌的对数生长期进行研究。通过比较沙门氏菌的生长曲线图，研究其生长趋势，确定了沙门氏菌的对数生长期，最后选定16h为沙门氏菌的培养时间；以对数生长期的沙门氏菌、单增李斯特菌等致病菌为研究对象，考察近红外光对致病菌细胞的作用，根据不同浓度梯度的沙门氏菌、单增李斯特菌的全细胞、细胞壁和细胞质的近红外光谱图谱，利用基于主成分分析技术（PCA）的投影判别分析，研究两种菌的近红外光谱鉴别方法。结果表明，不论是利用全细胞、细胞壁还是细胞质的近红外光谱分析，都可以将大肠杆菌和单增李斯特菌区分开来。关 键 词：近红外光谱，沙门氏菌，单增李斯特菌，主成分投影分析，鉴别方法 RESEARCH ON THE NEAR-INFRARED SPECTROSCOPY DISTINCTION METHOD OF PATHOGENIC BACTERIA CELLSFood and Bioengineering College Rong ZongyouTutor Liu JianxueABSTRACTThe pathogenic bacteria，which can cause the human illness to get sick or harm to human health of bacteria. Pathogenic bacteria contaminated food can cause food poisoning and food-borne infection，which is the significant hidden danger of food security. The near-infrared spectroscopy (NIRS)is one of the fastest growing testing technology，which take on the characteristic of nondestructive, fast, efficient, convenient and environmentally friendly.In this paper, we take the Salmonella and Listeria monocytogenes as the representative, using the methods of Plate crossed separation research the isolation and culture of Salmonella and L.monocytogenes. The results showed that，Salmonella and L.monocytogenes can be easily identified from Mixed bacteria With bismuth sulfite agar (BS) medium, modified MC Bride agar (MMA) medium. Taking the use of photoelectric turbidimetry, the logarithmic growth phase of Salmonella was researched. In this study, the growth curves of Salmonella were compared to their growth chart, from which we can see the growth trend of Salmonella. The logarithmic growth phase of Salmonella can be determinated. At last, 16h was selected to the Salmonella culture time. We take the logarithmic growth of Salmonella, Listeria monocytogenes pathogenic microorganisms for object of study, Inspects the near-infrared light function to the pathogenesis bacterial cell. A study about the near-infrared on the distinction method and the examination limit of both pathogenic bacteria cells had been carried out, using the projection discriminant analysis which is based on the principal component analysis (PCA). According to the different concentration gradient of near infrared spectra of the Salmonella and L.monocytogenes Whole-cell、cell wall and cytoplasmic, the Salmonella and L.monocytogenes can be distinguished.KEY WORDS：Near-Infrared spectroscopy，Salmonella， L.monocytogenes，PCA，Identification method目 录前 言1第1章 文献综述21.1 沙门氏菌的概论21.1.1 沙门氏菌的病原学特性21.1.2 沙门氏菌的发病机理21.1.3 沙门氏菌的临床症状31.2 单增李斯特菌的简介31.3 有害致病菌检测技术的概述31.3.1 色谱技术41.3.2 化学比色法41.3.3 近红外光谱检测技术41.4 近红外光谱概论51.4.1 近红外光谱分析技术的原理51.4.2 近红外光谱分析技术的特点61.4.3 近红外光谱分析技术的应用7第2章 材料与方法82.1 试验材料82.1.1 菌种82.1.2 试剂82.1.3 培养基82.1.4 试验仪器92.2 试验方法102.2.1 沙门氏菌的分离培养102.2.2 单增李斯特菌的分离培养112.2.3 沙门氏菌的生长曲线测定112.2.4 沙门氏菌全细胞、细胞壁、细胞质的制备122.2.5 单增李斯特菌全细胞、细胞壁、细胞质的制备132.2.6 沙门氏菌全细胞、细胞壁、细胞质的光谱采集132.2.7 单增李斯特菌全细胞、细胞壁、细胞质的光谱采集14第3章 结果与分析153.1 沙门氏菌的分离培养结果153.2 单增李斯特菌的分离培养结果153.3 沙门氏菌的生长曲线153.3.1 比浊法测定的吸光度153.3.2 生长曲线的绘制163.4 沙门氏菌、单增李斯特菌的鉴别方法研究173.4.1 沙门氏菌全细胞、细胞壁、细胞质的光谱图173.4.2 单增李斯特菌全细胞、细胞壁、细胞质的光谱图183.4.3 沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞的鉴别分析193.4.4 沙门氏菌、单增李斯特菌细胞壁的鉴别分析203.4.5 沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质的鉴别分析21第4章 结 论234.1 总结234.2 展望23参考文献25致谢27前 言沙门氏菌(Salmonella)是一种人畜共患和食源性疾病的致病菌。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。自19世纪后期，沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基上。此后的60年间，用于从食品中分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。虽然这些方法本身证明是可靠的，但却很费力、耗时，需要47天才能完成。单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)也是一种人畜共患病的病原菌。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。单增李斯特菌在各年龄段人群中均可发病，尤其免疫机能低下者和新生儿、孕妇、老年人等，病死率高达20%30%。应用常规方法检验耗时费力，程序复杂。采用聚合酶链反应(PCR)法检测，也需要24小时才能完成检测过程，仍然满足不了实时检测的需要。进入90年代，近红外分析技术逐步受到分析化学家的重视，应用逐步扩展到石油化工、医药、生物化学、烟草、纺织品等领域,现已发展成为一种独立的分析技术活跃在光谱分析领域。傅立叶变换近红外光谱(FTNIR)分辨率高，不仅能提供分子基团特征的振动吸收谱带，而且能敏锐地探测分子基团及周围环境的变化。细胞的近红外光谱能够反映核酸、蛋白质、糖蛋白和生物膜等分子在细胞内的含量、构型、构象及其所发生的变化。通过建立其近红外光吸收模型，找到食品中对数期的沙门氏菌、单增李斯特菌的近红外特征吸收光谱，使得不同致病菌能够区分开来。因此，通过不同浓度梯度的沙门氏菌、单增李斯特菌细胞的红外光谱来获得沙门氏菌、单增李斯特菌的近红外光谱信息，继而研究沙门氏菌、单增李斯特菌的近红外光谱的鉴别方法，将有可能对有害微生物的鉴别测定提供一种快速简便的检测方法，具有较好的应用前景。此外，近红外光谱分析技术在微生物学方面的应用，又可能为人类疾病的早期诊断提供科学依据。研究近红外光谱分析技术来检测食品中常见的致病菌，具有极大的经济和和社会效益。第1章 文献综述1.1 沙门氏菌的概论沙门氏菌属（Sallmonall）是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科中的一个大属，它包括2000多个血清型。病原学认为，沙门氏菌是一种人畜共患和食源性疾病的致病菌1。世界各地的食物中毒中，英国、中国沙门氏菌食物中毒居首位，美国居第二位。食源性致病菌作为一个严重的公共卫生问题是影响食品安全的主要原因之一，它严重危害着人们的生命健康从而造成重大经济损失2。因此，对致病性细菌的快速检测一直是相关研究的热点。1.1.1 沙门氏菌的病原学特性1、形态与染色沙门氏菌为革兰氏阴性，较为细长的杆菌，大小为（13m）（0.40.9m），不产生芽孢，一般无荚膜，但在黏液样变异时，可见菌体黏液层增厚。2、培养特性沙门氏菌为需氧或兼性厌氧菌。生长温度为1042，最适温度为37。适宜pH为6.87.8。对营养要求不高，一般在普通培养基上均能良好生长。在培养集中若加入硫代硫酸钠、胱氨酸、血清、葡萄糖、淀粉、脑心浸液、胶体硫或甘油等，均有助于本菌的生长。普通琼脂培养基：培养24小时后，形成中等大小、圆形或近似圆形、表面光滑、无色半透明、边缘整齐的菌落。普通肉汤培养基：生长良好，均等浑浊。3、抗原构造沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般可分为4种，即菌体抗原，又称为O抗原；鞭毛抗原，又称为H抗原；表面抗原，又称为K抗原；以及菌毛抗原。4、抵抗力沙门氏菌对热及外界环境的抵抗力属于中等，60作用2030min即被杀死3。1.1.2 沙门氏菌的发病机理沙门氏菌引起食物中毒时，需要感染大量病菌才能致病。沙门氏菌随食物进入消化道以后，在小肠和结肠里繁殖，附着于肠黏膜上皮并侵入粘膜下组织，使肠黏膜发炎，从而抑制了肠黏膜对水和电解质的吸收，并引起水肿、出血等。随后在通过肠黏膜上皮细胞之间侵入粘膜固有层，在固有层内引起炎症。未被吞噬细胞杀灭的沙门氏菌，经淋巴系统进入血液，而出现一时性菌血症，引起全身感染。同时活菌在肠道或血液内崩解出毒力较强的大量的菌体内毒素，而引起全身中毒症状。1.1.3 沙门氏菌的临床症状沙门氏菌食物中毒的临床症状是由活菌和内毒素的协同作用引起的，以急性胃肠炎型为最多，潜伏期一般1224h，有时可短至68h或长至2d，开始时症状为头痛、全身乏力、发冷和恶心等，以后出现呕吐、腹痛和全身酸痛。病人发热大都在3940，重病人出现寒战、抽搐和昏迷等。病程37d，一般愈后良好。但老人、儿童和体弱者，如不及时进行急救处理，也可导致死亡，死亡率约为1%左右4。1.2 单增李斯特菌的简介单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种人畜共患病的病原菌。本菌为兼性厌氧革兰氏阳性小杆菌，营养要求不高，无芽孢，耐碱不耐酸，对环境抵抗力较强。它广泛存在于自然界中，在4的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。单增李斯特菌属细胞内寄生菌，不产内毒素，可产生一种溶血性的外毒素。T细胞在清除本菌中起重要作用，细胞免疫功能低下和使用免疫抑制剂者较易感染，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。单增李斯特菌在各年龄段人群中均可发病，尤其免疫机能低下者和新生儿、孕妇、老年人等，病死率高达20%30%。1.3 有害致病菌检测技术的概述“民以食为天”，随着人们生活水平的提高，食品安全问题日益成为人们关注的焦点。据统计，全球每年腹泻病例15亿，造成300多万儿童死亡，其中70%是由于各种致病性微生物污染的食品和饮水所致。为此，食品检验日益显的重要，而微生物检验又是食品检验的一个重要内容。如何快速而准确地检测被称为“头号杀手”的食品中致病菌，是确保食品安全的首要任务。但是传统的微生物检验方法，包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验，不仅步骤复杂，而且耗时费力，难以适应飞速发展的现代食品生产和流通领域。因此为了确保食品的安全性，开发快速检测食品有害微生物的方法非常重要。目前，人们在微生物快速灵敏检测技术上投入了大量的精力，主要有色谱技术、化学比色法、阻抗技术、免疫分析技术、生物传感器技术、PCR技术、基因芯片技术、蛋白质芯片技术和生物学发光检测法。此外，一种新型的检测方法即近红外光谱检测技术也应运而生。1.3.1 色谱技术色谱技术的原理是将微生物细胞经过水解、甲醇分解、提取以及硅烷化、甲基化等衍生化处理后，使之分离尽可能多的化学组分供气相色谱仪进行分析。不同的微生物所得到的色谱图中，通常大多数的峰是共性的，只有少数的峰具有特征性，可被用来进行微生物鉴定，分析检测各种常见细菌、酵母菌、霉菌等。汤丹剑用全细胞水介皂化及甲醋法的方法，通过气相色谱仪检测了几株食品微生物细胞长链脂肪酸构成。结果表明在食品微生物领域中，利用细胞脂肪酸差异性进行菌种的快速鉴别是可行的，其鉴定结果与传统鉴别的结果相符。Newark微生物鉴定系统5就是用气相色谱法检测一种饱和脂肪酸(微生物代谢物)的含量，达到鉴定微生物的目的。1.3.2 化学比色法常用的化学比色法包括各种检测试剂和试纸，两者都是利用迅速产生明显颜色的化学反应检测待测物质，可通过与标准比色卡比较进行目视定性或半定量分析，随着检测仪器的不断发展，与其相配套的微型检测仪器也相应出现。在微生物检测方面，美国3M公司的petrifilm TM Plate系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数6。1.3.3 近红外光谱检测技术近红外光谱技术（NIRS）以未损伤细胞的近红外光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整个细胞组成分子的振动特征，也就是蛋白质、核酸等物质的特征，因此可以区分生化信息上的差别7。红外光谱法（FTIRS）早在20世纪50年代起就开始运用于区分不同的微生物8。1991年，Naumann等在Nature杂志中验证了FTIR具有判别、分类和鉴别微生物的能力9，这篇论文及其后续的相关文章成为红外光谱法在微生物研究领域的经典参考文献。Curk等用中红外进行了酵母菌的分类鉴别研究；Helm等对某些细菌的细胞组成用红外光谱方法进行了鉴别等10。研究表明，这些微生物大分子不仅在中红外谱区有吸收，在近红外谱区也有吸收。Janie Dubois等人利用细菌细胞在不同波长范围(1000 -2350nm)的近红外吸收11,通过近红外光谱技术对细菌进行了分类鉴定,从而揭开了近红外光谱技术在微观世界应用的序幕。此外，还有PCR技术、生物技术、基因芯片技术、蛋白质芯片技术、生物学发光检测法等。1.4 近红外光谱概论近红外谱技术（NIR）是20世纪80年代发展起来的一种高效快速的现代分析技术，在分析化学领域里被誉为分析“巨人”，它综合运用了计算机技术、光谱技术和化学计量学等多个学科的最新研究成果，以其独特的优势在多个领域得到了日益广泛的应用。并已逐渐得到大众的普遍接受和官方的认可。近红外区域按美国材料检测学会（ASTM）定义是指波长在7802526nm、波数为128203959cm-1范围内的电磁波12。习惯上人们将近红外区划分为近红外短波（7801100nm）和近红外长波（11002526nm）两个区域。近红外光谱主要是含氢基团C-H、O-H、N-H、S-H、P-H等振动的倍频和合频吸收的综合表现13。不同的物质含有不同的基团，而不同基团或同一集团在不同化学环境中的近红外吸收波长与强度都有明显差别，所以近红外光谱具有丰富的结构和组成信息，可以作为获取信息的一种有效载体，非常适合用于碳氢有机物质的组成性质测量。有机物分子对近红外光谱的各个波长的不同吸收率在光谱上表现出波峰和波谷，因此，近红外光谱主要用于有机物定性鉴定和定量分析14。1.4.1 近红外光谱分析技术的原理1、化学计量学尽管近红外光谱理论上非常适合用于碳氢有机物质的组成性质测量，但是在该区域内，含氢基团化学键振动的倍频与合频吸收强度很弱，灵敏度相对较低，吸收带较宽且重叠严重，因此，传统的定量分析比较复杂且困难。化学计量学的发展为这一复杂问题的解决奠定了数学基础。化学计量学（Chemometrics）综合使用数学、统计学和计算机学等方法，是一门从化学测量数据中提取信息的新兴的交叉学科。大量化学计量学方法被写成软件，并成为近红外光谱仪的重要组成部分15。2、工作原理近红外光谱分析技术是利用被测物质在其近红外光谱区内的光学特性快色估测一项或多项化学成分含量16,17。被测样品的光谱特征是多种组分的反射光谱的综合表现，各组分含量的测定基于各组分最佳波长的选择，按照回归方程自动测定结果：组分含量=C0+C1(Dp)1+C2(Dp)2+Ck(Dp)k （公式1-1）式中：C0k为多元线性回归系数；(Dp)1k为各组分最佳波长的反射光密度值(D=lgp，p为反射比)。该方程准确的反映了定标范围内一系列样品的测定结果，与实验室常规测定法之间的标准偏差SE为：SE=(y-x)2/(n-1)1/2 （公式1-2）式中：x表示实验室馋鬼法测定值，y表示近红外光谱法测值，n为样品数。1.4.2 近红外光谱分析技术的特点1、分析速度快NIR技术检测过程比较快速，可在很短时间内获得一个样品的全光谱图，光谱的测量过程一般可在1min内完成。2、多组分同时测定通过一次全光谱扫描，就可以得到样品中各种化学成分的光谱信息，再通过相应的数学模型来计算，即可获得样品多种化学成分的含量。3、简化分析过程运用近红外光谱分析技术不需要对样品进行预处理，是因为近红外区内光散色效应大，且穿透深度大，使得近红外光谱技术可以用漫反射技术对样品进行直接测定。因此使得分析过程变得尤其简单，大大减少劳动强度。4、仪器自动化程度高对操作人员的要求低，仪器可以根据操作人员的要求任意设置工作流程。5、远距离测定和实时分析近红外光在光纤中有良好的传输性能，因此近红外光谱分析技术具有远距离采集样品光谱和实时分析的能力，特别适用于在线分析。利用光导纤维技术远离主机取样，将光谱信号实时传送回主机，可直接计算出样品成分的即时含量或确定样品的性质。6、测试重现性好光谱的测定具有很好的重现性和稳定性，其测试受人为干扰因素较小。与常规的化学方法或参考标准相比，近红外光谱分析一般可显示出更好的重现性和精确性。7、典型的无损分析技术近红外光谱分析技术只是采集样品的光谱信息，不消耗样品，操作过程中不添加任何其它化学试剂，从外观到内在都不会对样品产生影响。8、分析成本低采用近红外光谱分析技术时，无需添加其他化学试剂，分析过程中不消耗样品，自身消耗一点电外几乎无其他消耗，与常用的标准或参考方法相比，测试费用可大幅度降低18,22。9、近红外光谱分析也有其固有的弱点测试的灵敏度相对中红外较低，主要是因为近红外光谱作为分子振动的非谐振吸收跃迁几率较低，一般近红外倍频和合频的谱带强度时其基频吸收的10到10000分之一，就对组分的分析而言，其含量一般应大于0.1%。1.4.3 近红外光谱分析技术的应用近红外光谱分析技术诸多优点决定了它应用领域的广阔。在食品行业方面，近红外光谱技术可用于食品的品质分析，如研究农产品的新鲜度、检测水果坚实度和品质、检测水果糖度和酸度、控制烤制品的质量、检测酒类发酵过程中酒精及糖分含量变化、预测不同肉类特性、测定乳制品中营养成分、辨别食用油的真伪等等23-26。在林业方面，其应用更有着常规方法无法比拟的优越性，如无损检测木材密度和性质、木材品质育种和种质资源鉴定、林业种子质量的检测、森林掉落物分解检测27,28。在农业方面，可应用于作物的品质分析和评价、用于作物品种资源鉴定和品质育种、用于作物抗性指标分析29,30。在药学研究领域，可对药物原料的晶粒大小、晶型、洁净度、表观密度和旋光性等进行全面的分析，可对药物制剂进行分析，也可进行药物的在线监测控制31。在烟草行业，主要是应用于对烟草化学成分的检测、烟气分析、烟叶类型或产地判别、卷烟配方识别、卷烟真伪鉴别、卷烟材料分析、烟叶物理指标测定等方面。在其它领域如石油化工、高分子化工和基本有机化工、纺织工业等也都有近红外光谱技术的广泛应用。近红外光谱技术在微生物领域的应用也有了新的发展，目前大部分的研究对象为细菌和酵母菌，少数为真菌和藻类。第2章 材料与方法2.1 试验材料2.1.1 菌种沙门氏菌、单增李斯特菌 （洛阳市疾病防治与控制中心）2.1.2 试剂表2-1 主要试剂及生产商Table2-1 The main reagent and manufactures试剂名称生产商牛肉膏北京奥博星生物技术有限责任公司蛋白胨北京双旋微生物培养基制品厂琼脂国药集团化学试剂有限公司氯化钠天津市津沽工商实业公司氢氧化钠天津市科密欧化学试剂有限公司胰胨国药集团化学试剂有限公司多价胨国药集团化学试剂有限公司酵母膏天津市津沽工商实业公司葡萄糖北京双旋微生物培养基制品厂磷酸氢二钾天津市科密欧化学试剂有限公司硫酸亚铁北京奥博星生物技术有限责任公司煌绿北京奥博星生物技术有限责任公司柠檬酸铋铵天津天达净化材料精细化工厂亚硫酸钠上海化学试剂总厂苯乙醇上海华亭化工厂有限公司无水甘氨酸武汉银河化工有限公司氯化锂成都科龙化工试剂厂乳糖成都科龙化工试剂厂蔗糖北京西美杰科技有限公司硫酸亚铁铵天津市科密欧化学试剂开发中心硫代硫酸钠北京西美杰科技有限公司酚红武汉银河化工有限公司2.1.3 培养基1、营养肉汤培养基 牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，加入1000mL水溶解，并调pH7.27.4，121高压灭菌15min。2、养琼脂培养基牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂18g，加入1000mL水溶解，并调pH7.27.4，121高压灭菌15min。3、含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉汤培养基（TSBYE）胰胨17g、多价胨3g、酵母膏6g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g、蒸馏水1000mL，121高压灭菌15min。4、含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂培养基（TSAYE）胰胨17g、多价胨3g、酵母膏6g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，121高压灭菌15min。5、亚硫酸铋琼脂（BS）培养基蛋白胨10g、牛肉膏5g、葡萄糖5g、硫酸亚铁0.3g、磷酸氢二钠4g、煌绿0.025g、柠檬酸铋铵2g、亚硫酸钠6g、琼脂20g、蒸馏水1000 mL，并调pH7.27.4，121高压灭菌15min。6、改良的MC Bride琼脂（MMA）培养基胰胨5g、多价胨5g、牛肉膏3g、葡萄糖1g、氯化钠5g、磷酸氢二钾1g、苯乙醇2.5 mL、无水甘氨酸10g、氯化锂0.5g、琼脂15g、蒸馏水1000 mL，并调pH7.27.4，121高压灭菌15min。7、SIM动力培养基胰胨20g、多价胨6g、硫酸铁铵0.2g、硫代硫酸钠0.2g、琼脂3.5g、蒸馏水1000mL，并调pH7.27.4，121高压灭菌15min。8、三糖铁琼脂（TSI）培养基蛋白胨20g、牛肉膏5g、乳糖10g、蔗糖10g、葡萄糖1g、氯化钠5g、硫酸亚铁铵0.2g、硫代硫酸钠0.2g、琼脂12g、酚红0.025g、蒸馏水1000 mL，并调pH7.27.4，121高压灭菌15min。2.1.4 试验仪器表2-2 主要仪器及生产商Table2-2 The main instruments type and manufactures仪器名称生产商高压蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂超净工作台苏州净化试验设备有限公司电子天平常熟市意欧仪器仪表有限公司电热恒温培养箱海跃进医疗器械一厂恒温振荡培养箱上海福玛试验设备有限公司低温冰箱青岛海尔股份有限公司可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司全自动控温摇床上海福玛实验设备有限公司电热鼓风干燥箱北京市永光明医疗仪器厂台式高速控温离心机长沙离心机仪器有限公司台式低速控温离心机长沙离心机仪器有限公司超声波细胞粉碎仪宁波新芝生物科技股份有限公司VECTOR-33型傅立叶变换红外光谱仪德国Bruker公司2.2 试验方法2.2.1 沙门氏菌的分离培养1、沙门氏菌的活化从冰箱中取出含有杂菌的沙门氏菌试管斜面，在超净工作台，用接种环取一环接入营养琼脂平板倒置于37恒温培养箱中培养24h。2、沙门氏菌的分离培养取出活化后的平板，在超净工作台，挑取几个可疑的发育良好的孤立菌落，划线接种于亚硫酸铋琼脂（BS）平板，倒置于37恒温培养箱中培养24h。3、沙门氏菌的观察培养24h后，从恒温培养箱中取出平板，观察沙门氏菌的生长情况。必要的时候用放大镜观察。注意事项：实验中用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。灭菌后，通常在6080烘箱中除去灭菌时的水分。物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是有利于锅内温度升高，随后关闭排气阀继续加热，加热结束切断热源后，要使温度自然降低，气压务必降至零时打开锅盖，其目的是防止容器中的液体暴沸。在用任何器皿转接时，瓶塞和封口膜只能夹在手上，不许放在台面上，接种时要在酒精灯火焰旁操作。培养基一定不能沾在三角瓶口、试管管口和培养皿壁上，否则容易污染。接种时要胆大心细，动作快捷，这是减少污染的关键。接种后，培养皿必须倒放（盖在下方）在恒温培养箱中，如正放则水蒸气在盖上凝成水滴，滴到接种后的培养基表面，水流扩散会使菌落扩散，就很难形成单菌落了。2.2.2 单增李斯特菌的分离培养1、单增李斯特菌的活化从冰箱中取出含有杂菌的单增李斯特菌试管斜面，在超净工作台，用接种环取一环接入（TSAYE）平板倒置于37恒温培养箱中培养24h。2、单增李斯特菌的分离培养取出活化后的平板，在超净工作台，挑取几个可疑的发育良好的孤立菌落，划线接种于改良的MC Bride琼脂（MMA）培养基平板，倒置于30恒温培养箱中培养48h。3、单增李斯特菌的观察培养24h后，从恒温培养箱中取出平板，观察单增李斯特菌的生长情况。必要的时候用放大镜观察。2.2.3 沙门氏菌的生长曲线测定1、试验原理将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以含菌量作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解细菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。处于对数生长期的细胞随时间变化成倍增长，菌体生长代谢旺盛，繁殖力、抗不良环境和噬菌体的能力强，活力最佳，最适合进行试验研究。故本试验采用处于对数生长期的沙门氏菌进行研究。2、试验步骤、沙门氏菌的活化及分离纯化将沙门氏菌接入营养琼脂平板中，倒置于37恒温培养箱中培养24h。取出活化后的平板，挑取单个菌落，划线接种于营养琼脂培养基培养24h。、沙门氏菌种子液的制备挑取纯化培养后的沙门氏菌单个菌落，将其接种于装有50mL营养肉汤培养基的三角瓶中，37 210r/min振荡培养24h。、比浊法测定沙门氏菌的生长曲线取25支大试管，用记号笔标明培养时间，即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 h。在超净工作台中，用移液枪准确吸取25mL培养24h后的沙门氏菌种子液，移于装有500mL营养肉汤培养基的大三角瓶中，快速摇匀。立即分装于已编号的25支大试管中，每支试管装15mL，将分装后的试管置于摇床上，37 210r/min振荡培养。分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 h将编号为对应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同测定光密度值。以未接种的营养肉汤液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。按编号从小到大的顺序依次进行测定。2.2.4 沙门氏菌全细胞、细胞壁、细胞质的制备按照方法2.2.1进行沙门氏菌细胞的活化和分离纯化，由结果与分析3.3.2中所得结论选择16h进行沙门氏菌种子液的制备，之后3000r/min离心分离湿菌体，以一定体积无菌水分三次洗涤沉淀部分，充分震荡摇匀使菌体分散开来，平板菌落计数法进行菌落计数结果为80亿/mL。另用移液枪移取1mL菌液于大试管中，加入9mL无菌水，充分振荡摇匀形成10倍稀释菌悬液，然后逐级进行19次10倍稀释，制成一组20个浓度梯度的沙门氏菌全细胞悬液，浓度梯度值呈比差为10的等差序列，备用。用超声波细胞粉碎仪破碎沙门氏菌的全细胞，破碎参数选为400W、破碎5s、间隔5s、实际破碎总时间50min进行沙门氏菌细胞破碎，之后15000r/min离心分离，沉淀部分为细胞质、上清液为细胞质。将细胞质悬液充分震荡摇匀，用移液枪移取1mL菌液于大试管中，加入9mL无菌水，充分振匀形成10倍稀释菌悬液，然后逐级进行19次10倍稀释过程，制成一组浓度梯度的沙门氏菌细胞质悬液，20个浓度梯度值呈比差为10的等差序列，备用。一组20个浓度梯度的沙门氏菌细胞壁悬液的制备同细胞质悬液制备过程。2.2.5 单增李斯特菌全细胞、细胞壁、细胞质的制备单增李斯特氏菌样品的制备：对单增李斯特氏菌进行细胞的活化和分离纯化，选18h进行单增李斯特氏菌种子液的制备，之后3000r/min离心分离湿菌体，以一定体积无菌水分三次洗涤沉淀部分，充分震荡摇匀使菌体分散开来，平板菌落计数法进行菌落计数结果为175亿/mL。选择超声波破碎参数为500W、破碎4s、间隔5s、实际破碎总时间80min进行单增李斯特氏菌细胞破碎，之后15000r/min离心分离，沉淀部分为细胞壁、上清液为细胞质。三组10倍稀释浓度梯度的单增李斯特氏菌细胞壁、细胞质悬液的制备同沙门氏菌。2.2.6 沙门氏菌全细胞、细胞壁、细胞质的光谱采集1、主成分分析方法介绍主成分分析（principal component analysis，PCA）是多元统计中的一种数据压缩技术，该方法广泛用于化学实验数据的统计分析，是化学计量学中的基础方法32。PCA是对多变量数据进行统计处理的一种数据线性投影方法，它在尽可能保留原有信息的基础上将高维空间中的样本映射到较低维的主成分空间中。通过分析原始数据的相互关系，采用坐标变换的方法对数据进行正交变换，消除数据间的相关关系，具有分析多变量主次关系的功能。近红外光谱带严重重叠，可造成分析的困难，而PCA在不丢失主要光谱信息的前提下选择为数较少的新变量来代替原来较多的变量 ，可有效解决光谱重叠的问题，从而提取所需的化学信息。2、试验参数选择 、分辨率 仪器的分辨率影响近红外光谱的分析，而且对不同组分的影响是不同的，对于光谱重叠严重的部分，提高分辨率有利于光谱的分析，但过高会大大增加试验和数据处理工作量。有研究表明，当分辨率大于4cm-1时，部分样品信息损失，较低的分辨率可以保证信噪比，综上本试验设分辨率为4cm-1。、扫描次数 扫描次数是在一次测量过程中对光谱的累加，累加后的光谱除以扫描次数即为每个样本的平均光谱。由于噪音在测量过程中是随机变化的，随着累加次数的增加，噪音相互抵消，影响变小，本实验设扫描次数为64 次。、重复测定次数 在测量过程中，同一样品的多次测定，光谱会出现细微变化（偶然误差影响），为了尽可能准确地取得样品的光谱信息，一般一个样品重复测定3次，取平均光谱值33。3、光谱信息的采集在相同的试验条件下，采用德国Bruker公司的VECTOR-33型近红外光谱仪，对沙门氏菌的各组份进行近红外光谱进行透射扫描。为了获得较好的光谱图，整个试验的仪器分辨率、扫描次数等参数保持严格一致。设定仪器分辨率为4 cm-1，扫描次数为64次，扫描范围400012000 cm-1，环境温度控制在20左右，空气湿度70%左右，数据格式为Log(1/R)，每个样品重复扫描3次，其平均值作为该样品的光谱数据，每张光谱包含2075个波长点的吸光度值34。2.2.7 单增李斯特菌全细胞、细胞壁、细胞质的光谱采集单增李斯特菌全细胞、细胞壁、细胞质光谱信息的采集，条件和方法同沙门氏菌。第3章 结果与分析3.1 沙门氏菌的分离培养结果典型的沙门氏菌菌落在亚硫酸铋（BS）琼脂上呈褐色，灰色或黑色，有时带有金属光泽。菌落周围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有所谓的晕环效应。取出平板看到呈褐色，灰色或黑色，带有金属光泽的菌落。并且菌落周围的培养基开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为了黑色，可以认为即是沙门氏菌。接种到营养琼脂试管斜面上放在冰箱中保存，以备下一步试验用。3.2 单增李斯特菌的分离培养结果取出平板，挑取可疑菌落，用白炽灯45角斜光照射平板，可以看出菌落为灰蓝或蓝色、小的圆形菌落。挑取几个发育良好的孤立菌落接种于三糖铁（TSI）琼脂和SIM动力培养基，培养于25的恒温培养箱中，观察到有动力，且呈伞状或月牙状生长的菌落。即可以认为是单增李斯特菌。接种到（TSAYE）试管斜面上放在冰箱中保存，以备下一步试验用。3.3 沙门氏菌的生长曲线3.3.1 比浊法测定的吸光度比浊法是用分光光度计测定培养液中微生物的数量。由于细菌悬液的浓度与吸光度（OD）值成正比，因此可利用OD值来推知菌液的浓度，并将测得的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出沙门氏菌在一定生长条件下的生长情况曲线图。以未接种的营养肉汤培养基作空白对照，选用600nm波长进行比浊测定，按编号从小到大的顺序依次进行测定。沙门氏菌比浊测定结果吸光度（OD）值见表3-1。表3-1 沙门氏菌菌液OD值Table3-1 The value of optical density of Salmonella培养时间（h）吸光度（OD）值空白对照0.04110.04120.04230.04240.04350.04460.04970.05480.05890.062100.066110.069120.071130.074140.075150.077160.079170.083180.084190.083200.084210.084220.084230.083240.0823.3.2 生长曲线的绘制由表3-1沙门氏菌菌液OD值，以沙门氏菌培养时间为横坐标、以菌液光密度值为纵坐标，绘制沙门氏菌生长曲线图3-1。图3-1 沙门氏菌生长曲线图Fig.3-1 The growth curve of Salmonella由图3-1可知，沙门氏菌在0-5h特征表现为生长迟缓，5-16h生长迅速、呈对数生长趋势，16h以后逐渐进入稳定期和衰亡期。此沙门氏菌生长曲线与典型生长曲线有所不同，对数期很长,长达11个小时，但基本符合典型生长曲线延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期的划分。5-16h为沙门氏菌的对数生长期。比浊法测定的是活菌数和死菌数之和，所绘制的生长曲线可能会有一定的误差，但这并不影响生长曲线所反映的沙门氏菌的生长情况。从图3-1沙门氏菌生长曲线可以看出，光电比浊法所测生长曲线基本符合典型的沙门氏菌生长曲线图。图3-1分析可知5-16h为沙门氏菌的对数生长期，本实验选择可选16h为沙门氏菌的培养时间，从而进行下步的试验。3.4 沙门氏菌、单增李斯特菌的鉴别方法研究3.4.1 沙门氏菌全细胞、细胞壁、细胞质的光谱图由2.2.6得到不同浓度的沙门氏菌全细胞、细胞壁和细胞质的近红外光谱叠加图如图3-2、图3-3、图3-4所示。图3-2 沙门氏菌全细胞的原始光谱Fig.3-2 NIRS spectrum of Escherichia Salmonella whole-cell图3-3 沙门氏菌细胞壁的原始光谱Fig.3-3 NIRS spectrum of Escherichia Salmonella wall图3-4 沙门氏菌细胞质的原始光谱Fig.3-4 NIRS spectrum of Escherichia Salmonella cytoplasm3.4.2 单增李斯特菌全细胞、细胞壁、细胞质的光谱图由2.2.7得到不同浓度的单增李斯特菌全细胞、细胞壁和细胞质的近红外光谱叠加图如图3-5、图3-6、图3-7所示。图3-5 李斯特菌病全细胞的原始光谱Fig.3-5 NIRS spectrum of Escherichia LM whole-cell图3-6李斯特菌病细胞壁的原始光谱Fig.3-6 NIRS spectrum of Escherichia LM wall图3-7李斯特菌病细胞质的原始光谱Fig.3-7 NIRS spectrum of Escherichia LM cytoplasm3.4.3 沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞的鉴别分析图3-2是以沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞不同波数点下的吸光度值为特征值，进行多元散射预处理后进行PCA分析，选取前两个主成分拟合原数据的效果图，图中横纵坐标的标注分别是第一主分和第二主分的得分值。图3-2 沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞主成分得分图Fig.3-2 The PCA score of Salmonella and LM whole-cell从图中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞的差异性信息。沙门氏菌第一组分得分范围在-0.050.03之间，第二组分得分范围在-0.13-0.02之间；单增李斯特菌第一组分得分范围在-0.090.04之间，第二组分得分范围在0.010.25之间。可见两种菌的第一主分得分范围几乎完全相同，而第二主分得分范围明显不同。不同的细菌，其细胞的物质组成是不一样的。不同的物质在经过近红外光照射后会在不同的波段产生红外特异性吸收，且有着不同的吸收谱段，因此可以通过近红外光谱法区分开来。3.4.4 沙门氏菌、单增李斯特菌细胞壁的鉴别分析图3-3是以沙门氏菌、单增李斯特菌细胞壁不同波数点下的吸光度值为特征值，进行多元散射预处理后进行PCA分析，选取前两个主成分拟合原数据的效果图，图中横纵坐标的标注分别是第一主分和第二主分的得分值。图3-3 沙门氏菌、单增李斯特氏菌细胞壁主成分得分图Fig.3-3 The PCA score of Salmonella and LM wall从图中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙门氏菌、单增李斯特菌细胞壁的差异性信息。沙门氏菌第一组分得分范围在-0.100.05之间，第二组分得分范围在-0.020.15之间；单增李斯特菌第一组分得分范围在0.050.28之间，第二组分得分范围在-0.30-0.02之间。可见两种菌的第一主分和第二主分得分范围完全不同。细菌的细胞壁都含有一定量的肽聚糖，此外，革兰氏阴性菌的细胞壁还含有外膜这一特殊组分，包括脂多糖、脂质双层、脂蛋白三部分；革兰氏阳性菌还含有大量特殊组分磷壁酸。沙门氏菌为革兰氏阴性菌，单增李斯特氏菌为革兰氏阳性菌，其细胞壁组分不尽相同，不同的物质在经过近红外光照射后会在不同的波段产生红外特异性吸收，且有着不同的吸收谱段，因此可以通过近红外光谱法区分开来。3.4.5 沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质的鉴别分析图3-4是以沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质不同波数点下的吸光度值为特征值，进行多元散射预处理后进行PCA分析，选取前两个主成分拟合原数据的效果图，图中横纵坐标的标注分别是第一主分和第二主分的得分值。图3-4 沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质主成分得分图Fig.3-4 The PCA score of Salmonella and LM cytoplasm 从图中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质的差异性信息。沙门氏菌第一组分得分范围在0.040.12之间，第二组分得分范围在-0.22-0.10之间；单增李斯特菌第一组分得分范围在0.020.06之间，第二组分得分范围在-0.030.12之间。可见两种菌的第一主分得分范围有相似的地方，而第二主分得分范围明显不同。细菌的细胞质是指被细胞膜包围的除核区以外的一切半透明、胶体状、颗粒状物质的总称，主要成分为核糖体、贮藏物、各种酶类、中间代谢物、质粒、各种营养物质和大分子的单体等。两种不同的细菌其细胞质组分部分也不同，所以可以通过近红外光谱法区分开来。第4章 结 论4.1 总结1、采用平板划线分离培养法和选择性培养基对沙门氏菌、单增李斯特菌进行分离培养，试验结果表明，用亚硫酸铋琼脂（BS）培养基、改良的MC Bride琼脂（MMA）培养基，根据沙门氏菌、单增李斯特菌在选择性培养基的典型菌落特征，可将其从杂菌中很好的分离开来。2、采用比浊法对沙门氏菌的生长曲线进行研究，并绘制生长曲线图。了解它们在不同时间段的生长趋势。研究表明：沙门氏菌在5-16h为对数生长期。所以可选取液体培养16h沙门氏菌进行后续试验。3、根据不同浓度梯度的沙门氏菌、单增李斯特菌的全细胞、细胞壁和细胞质的近红外光谱，通过矢量归一法处理方法，利用基于主成分分析技术的投影判别分析，研究两种菌的近红外光谱鉴别方法。结果表明，不论是利用全细胞、细胞壁还是细胞质的近红外光谱分析，都可以将沙门氏菌和单增李斯特菌区分开来。4、近红外光谱分析技术可以用于进行沙门氏菌、单增李斯特菌的分类鉴别。本文结果表明不同致病菌的细胞组成是不相同，由于不同的组分可对近红外光产生特异性吸收，因此近红外光谱法可以通过致病菌的不同近红外光谱图谱区分不同细菌种类，为建立一种快速的致病菌检测方法提供依据。但是，到底是什么物质引起近红外光产生特异性吸收还不知道，尚需进一步研究，还有利用近红外光谱分析技术对更多种类致病菌的检测技术也需要进一步研究。4.2 展望我国已进入WTO，减员增效成为国内企业改革的重要措施之一，近红外分析技术的应用，可提高生产的自动化程度，节省大量人力。随着我国工业生产水平和生活水准的不断提高，最终近红外技术的应用也像发达国家的一样。正因为如此，目前国外各大近红外光谱分析仪器厂家都看好中国市场，纷纷投入了大量人力和物力，争夺中国的巨大市场。就炼厂而言，常、减压蒸馏、催化裂化、各种产品调和工艺，还有加氢和重整等工艺都非常需要在线NIR，每套装置至少需要一套在线近红外过程分析仪，按此预计我国石化需要几千套。同样，化工工业也有类似情况。而引进一台在线近红外过程分析仪，一般在200至600万人民币。对于农业粮食、食品和医药部门的需求从数量上更是巨大，因此，我国对这一技术具有巨大的潜在市场，在数量上和规模上，其他国家无法与我国相比，属于关系到国计民生的关键技术。由于近红外光谱包含了C-H，O-H，N-H以及其他化学键的振动信息，近红外光谱测量方式包括透射、漫反射，可以测量液态和固态样品。所以，近红外应用的领域范围极其广泛。根据我国“十一五”期间的科学发展观，由资源消耗和粗放生产管理向节约型和生产优化与精确控制型转化，建立人与自然协调发展的社会。质量管理提到了很高的地位。近红外分析技术作为质量管理所依靠的重要技术手段之一，在未来具有光明的应用前景。目前近红外分析作为新技术在我国的市场已经初步形成，目前每年近红外