河南大学大学生创新创业训练计划项目申请书.doc

河南大学大学生创新创业训练计划项目申 请 书项目名称： 促透膜纳米混悬剂克服药物外排的研究 项目负责人： 学 号： 所在学院： 年级专业： 填写日期： 河南大学大学生创新创业训练计划工作领导组制填写说明一、封面中的项目编号由学校统一编排填写。二、申请书中第2页和第一至第五项的内容，经项目团队人员共同讨论并征得指导教师意见后，由项目负责人主持填写。三、“项目所属学科”按教育部1998年颁布的“普通高等学校本科专业目录”中的哲学、经济学、法学、教育学、文学、历史学、理学、工学、农学、医学和管理学11个一级学科门类中的一种或多种(跨学科)；“学业能力与获奖情况”指项目负责人已经获取的成果和奖励，如正式发表的学术论文、创作、专利、参加完成的科研课题、被社会及生产实际采用的成果和校级以上的各种学业奖励（挑战杯、电子设计大赛等），均须提供复印件，随申请书一并报送。四、所填内容要符合河南大学大学生创新性实验计划项目管理办法要求，实事求是、简明清晰、具体可靠。对提供虚假材料或信息数据不实者，将取消申报资格，并承担相应责任。五、格式要求：封面使用小三号字体，表格中使用五号字体，所填写的文字用宋体，数字及其他用Times New Roman，单倍行距。需签字部分须由相关人员用黑色钢笔或水笔签名。A4纸双面打印，左侧装订。六、项目申请书一式二份，报教务处一份、所在学院一份。项目名称促透膜纳米混悬剂克服药物外排的研究项目所属一级学科申请经费（元）10,000起止时间 年 月至 年 月项目负责人基本情况姓 名性别出生年月政治面貌联系电话E-mail学业能力与获奖情况项目团队（含负责人）姓 名性别 学号所在学院、专业 年级项目分工12345指导教师姓 名性别出生年月学历职称所在单位联系电话第一指导教师的业务特长与主要学术成果一、主要研究内容及研究价值、目前国内外研究现状、本项目的创新与特色目前，经高通量筛选获得的药物中约40因水溶性问题而使用受限，常使潜在的重要药品不能上市或充分发挥疗效。据估计，全球每年约有650亿美元的药品因生物利用度差，造成患者花费大、疗效小等问题。如BCS第2和4类药物，无论是用于静脉给药，还是口服给药，水溶性都是限制其使用的主要因素，如静脉给药必须使用水性介质，而口服给药要求药物在胃肠道内完全溶出。剂型的合理设计可以克服这一难题、确保静脉给药的可行性、提高口服生物利用度（吴镭, et al, 2003）。因此，药物新剂型的研究和制剂新技术的应用是其开发成功的关键。研究表明（Rabinow BE, et al, 2004），纳米混悬剂(nanosuspensions)可以较好地解决难溶性药物的水溶性问题。纳米混悬剂是采用少量的表面活性剂或聚合物材料稳定的“纯”药物粒子分散于液体中形成的一种亚微米胶体分散体系。无论是难溶于水的药物还是既难溶于水又难溶于油的药物，都可以制备得到相应的纳米混悬剂。纳米混悬剂具有以下优点：纳米混悬剂具有降低静注给药体积和减少药物的化学变化。如有文献报道纳米混悬剂可以增加奥美拉唑（Schwitzera JM, et al, 2004）、羟基喜树碱（Pu X, et al, 2009）、槲皮素（Gao L, et al, 2011）和水飞蓟素（赵晓宇, et al, 2009）的化学稳定性。生物利用度高。一方面，它可以通过降低粒径、增加比表面积，从而增加药物的溶出速率，进而提高药物的生物利用度（Jinno J, et al, 2006）；另一方面，由于比表面积大，纳米结晶对胃肠道生物膜有很强的粘附性（Mller RH, et al, 2002），不易被清除，从而延长药物在胃肠道的吸收时间，增大药物的生物利用度。生物安全性好。其载药量高，可以避免附加成分或减少载体材料的使用，从而能拚弃或降低附加成分引起的毒副作用，尤其适合高剂量、难溶性药物的各种途径给药。有一定的药物控释和靶向性。纳米混悬剂粒径较大时有一定的控释作用，且通常能被动靶向到巨噬细胞系统，采用合适的修饰技术也可以实现主动靶向。至今文献报道中的药物纳米混悬剂有几十种，其中包括一些中药的难溶性成分，但是已批准上市的品种只有6个（1个注射剂，5个口服制剂），且没有一个是以液体形式存在的。导致此种现象的因素有多方面，如制备工艺复杂、物理稳定性差、有机溶剂残留和传统灭菌方法不适合等，其中物理稳定性问题是纳米混悬剂应用及产业化的瓶颈。如申请人曾研究了羟基喜树碱注射用纳米混悬剂的稳定性，在4下保存其粒径仅能稳定10天，即使冷冻干燥后也只能在4下放置6个月（Pu X, et al, 2009）；另外Nakarani等（Nakarani M, et al, 2010）制备的环孢素A纳米混悬剂仅能稳定3个月，而橙皮素纳米混悬剂的原始粒径只能维持30天（Mishra PR, et al, 2009）。因此，为了能够制备出更加稳定的纳米混悬剂，开展纳米混悬剂物理稳定性的基础研究是极为必要的。影响纳米混悬剂稳定性的影响因素有稳定剂的稳定作用、制备方法、药物性质等等，其中稳定剂的稳定作用是最重要的因素。目前已有的研究结果表明，稳定剂对药物分散体系的稳定作用主要表现为以下3个方面：立体稳定、静电稳定和静电立体稳定（Apte SP, et al, 2003），其中静电立体稳定对药物分散体系的稳定效果最好（Ain-Ai A, et al, 2003），这主要是因为静电立体稳定能同时提供立体位阻作用和静电排斥作用，使粒子间有足够大的排斥力，从而阻止粒子聚集。另外人们从各种纳米粒的稳定性实验中发现以下规律：无论是立体稳定还是静电稳定，作为药物分散体系稳定剂都必须一方面与药物微粒有足够强的亲和力，以便能牢固地吸附在微粒表面上，使微粒表面被完全覆盖；另一方面要对相邻的微粒有足够大的排斥力。此外，物质分子之间的相亲性通常遵循“相似相容原理”。因此，稳定剂分子中必须具有与疏水性药物微粒表面性质相近的部分，以便能与药物微粒表面产生较强的亲和力。也就是说对于难溶性药物来说，选择带有强疏水基团的稳定剂能明显提高纳米混悬剂的制备成功率，但是不能保证长期稳定性（Van Eerdenbrugh B, et al, 2009）。而为了使微粒之间产生足够大的排斥力，对于立体稳定剂分子来说，要求与溶剂有良好的亲合性以便分子链充分伸展，形成厚的吸附层，保护微粒不聚集；对于静电稳定剂分子来说，要求必须带有足够量的电荷才能产生较强的静电排斥力。另外，为了实现纳米给药系统中药物的特异组织靶向性，靶向因子必须能稳定而长期地结合在药物纳米粒的表面，以便最终实现定位导向作用，而这些目标的实现也要求纳米给药系统有一个稳定而坚固的结构。随着分子生物学和生物药剂学的发展，人们发现药物的跨膜转运虽然以自由扩散方式为主，但是载体蛋白转运在药物的体内吸收、转运、分布、排泄过程也起着重要作用，尤其是对抗肿瘤药物的吸收与体内组织分布影响重大，主要表现在限制抗肿瘤药物的口服吸收和细胞外排。目前常用的逆转转运蛋白引起的抗肿瘤药物口服吸收差和肿瘤细胞外排的策略有使用纳米粒给药系统、抑制细胞外排的药物和高分子赋形剂等。近年来人们发现TPGS是一种应用前景非常好的生物材料，它具有良好的吸收促进作用和抗多药耐药作用，尤其是对ABC转运蛋白有较强的、制作用。TPGS本身也是一种两亲性共聚物，还具有较强的乳化能力，因此将其作为纳米混悬剂的辅助稳定剂，将会起到锦上添花的作用。因此，设计一种立体稳定和静电稳定一体化的稳定剂并应用于新型纳米混悬剂的制备将是一项具有重要意义的工作，若能对这种新型纳米混悬剂进行靶向性修饰，实现纳米混悬剂的释药定向化，同时合并抑制转运蛋白的外排作用，这将使纳米混悬剂的研究事半功倍。到目前为止，国家自然科学基金委已资助的科研项目中，有关纳米混悬剂的研究有2项，其中关于稳定性和抑制药物外排的研究各1项。但尚未见到有关报道立体稳定、静电稳定和靶向释药多功能一体化的稳定剂的设计和合成的研究，更未见到将纳米混悬剂的稳定性、靶向性和抑制药物外排进行协同研究的报道。可以预见，如果能够利用两亲性共聚物双亲性，设计一种靶向修饰的两亲性荷电共聚物，并用其结合抑制药物外排技术制备纳米混悬剂，协同研究纳米混悬剂的稳定机理、靶向作用和抑制药物外排作用，将是此研究领域中的一个里程碑。目前，人们对两亲性共聚物研究亦是方兴未艾，而且两亲性共聚物的种类、结构也层出不穷。其中可生物降解的聚氨基酸化合物近年来一直是人们研究的热点。它具有良好的生物相容性、对生物体无毒、无副作用，并可以通过体内的水解或酶解反应最终降解为小分子的氨基酸，被人体吸收或排出体外等优点（Rypacek F, et al, 1998）。因此，聚氨基酸化合物被广泛的用于医药领域，如药物缓控释体系等方面。在以前的报道中，均聚氨基酸一般作为疏水性链段和其他亲水性聚合物链段一起构成双亲性的嵌段共聚物。人工合成的聚氨基酸的共聚物多是非嵌段的共聚物，嵌段共聚氨基酸的报道很少。如近年来国内外科学家所研究的聚氨基酸类两亲性嵌段共聚物（Poly(amino acid)s amphiphilic block copolymer，简称“PAA-ABC”）主要有（张国林, et al, 2006; Lee ES, et al, 2003; 王勇, et al, 2009; 王书峰, et al, 2006; Prompruk K, et al, 2005）：聚乙二醇-聚氨基酸类嵌段共聚物、聚谷氨酸-聚丙氨酸嵌段共聚物、聚谷氨酸-聚亮氨酸嵌段共聚物、聚天冬氨酸丙酯-聚天冬氨酸嵌段共聚物、聚乙二醇-聚天冬氨酸/苯丙氨酸嵌段共聚物等。如果将其作为纳米混悬剂的稳定剂，PAA-ABC的疏水段可以吸附于纳米粒表面，或插入纳米粒子中，而亲水端围绕在纳米粒周围伸展到水中，形成强亲水性的外壳，将纳米粒核即纯药物粒子包裹在中央形成核-壳结构（结构见图1）。这种紧密而牢固的结构，为纳米混悬剂的靶向性修饰提供了坚实的平台，另外再联合TPGS，使其结构更加牢固，而且能赋予纳米混悬剂促吸收、抑制细胞外排的作用，使纳米混悬剂的研究迈向多功能化领域。迄今为止，FDA已经批准了6个纳米结晶产品上市，并且有多个品种处于临床研究阶段。但是由于稳定性问题，很多药物的纳米混悬剂仍不能被开发上市。目前文献中已报道的药物纳米混悬剂有四、五十种（Pu X, et al, 2009），其中只有少数稳定性好，而大部分稳定性较差。针对这种稳定性的问题目前研究得还不够深入，研究纳米混悬剂的稳定机制有助于深入、彻底地理解不同稳定剂对不同药物的稳定机理。另外，申请人至今还未见到纳米混悬剂靶向性修饰研究的报道，它的抑制细胞外排作用研究更是一片空白。图1 核-壳式纳米混悬剂的结构目前仅有三个课题组（Ain-Ai A, et al, 2008; Van Eerdenbrugh B, et al, 2009; Raghavan SL, et al, 2001）对纳米混悬剂稳定性与稳定剂性质和药物性质之间存在的潜在关系做出了推测，如阐述了立体稳定、静电稳定的作用效力，稳定剂与纳米粒之间可能存在的作用力，以及稳定剂的粘度、疏水性、药物分子的疏水性等因素与稳定性之间的定性关系，提出了纳米混悬剂的稳定规律。但是，该类研究没有涉及到纳米混悬剂的具体稳定机制，也没有深入探究稳定剂和药物的性质与稳定性之间的量化关系，更没有充分考虑稳定剂对药物和溶剂的双向亲和性以及空间稳定与静电稳定结合的牢固性对稳定性的影响。因此，该类研究略显肤浅、不够全面。总之，纳米混悬剂的稳定机制研究是药剂科学家们亟待开展的工作，而这一工作的顺利进行将有利于促进纳米混悬剂长远发展和大力推广。结合申请人及课题组的研究基础、工作条件和其他纳米粒的相关报道（苗先烽, et al, 2008; Yukishige K, et al, 1995），本课题拟以PAA-ABC和纳米混悬剂的稳定性为研究对象，深入开展纳米混悬剂的稳定机制研究。即合理设计聚氨基酸类两亲性共聚物的化学组成和结构，从分子水平上调整两亲性共聚物的结构和性能。通过考察不同化学组成、结构的聚氨基酸类两亲性共聚物的疏水相亲性，其疏水相亲性与纳米混悬剂的稳定性的定性定量关系，溶液pH值影响纳米粒的zeta电位、稳定性的规律，揭示聚氨基酸类两亲性共聚物对纳米粒的吸附及稳定的作用机制，为深入研究纳米混悬剂的稳定机理迈出关键的一步。同时，利用这种新型纳米混悬剂具有的稳定性良好的核壳结构，并结合TPGS的乳化作用、促吸收作用和抗多药耐药作用，制备出一种多功能的促透膜纳米晶给药体系，也为纳米混悬剂的基础研究和开发应用提供可靠的理论依据和新思路。二、已具备的条件（含已具备的知识、技能、特长、实验条件、研究基础等）我校是河南省重点建设高校，2008年跨入省部共建高校行列，拥有棉花生物学国家重点实验室、特殊功能材料教育部重点实验室、植物逆境生物学教育部重点实验室和河南省纳米材料工程技术中心等多个国家级或省级重点科研机构。河南大学药学院具有河南省重点学科药剂学、河南省医学重点学科药效学以及河南省重点实验室天然药物化学和遗传工程实验室，是河南大学重点建设学院。科研仪器方面，药学院拥有多种先进仪器，如粒度测定仪、Zeta电位测定仪、荧光光度计、高速分散匀质机、高压匀质机和低温超高速离心机等现代化测试仪器。此外还有旋转蒸发仪、冻干机、真空干燥机等常用设备。申请人将以河南大学药学院和特种功能材料教育部重点实验室为工作平台开展本项目的研究工作。这个平台拥有多种先进的现代高分子材料分析设备，如接触角测定仪、SEM、DSC、TEM、荧光显微镜、XPS及AFM等。河南大学校内还拥有NMR，红外光谱，质谱仪，凝胶渗透色谱等化合物表征仪器。以上实验条件将为本项目研究工作的顺利完成提供便利和保障。总之，我们已具备进行本项研究的各项实验条件。三、项目实施方案及进度安排（按月份列出）（1） PAA-ABC的结构设计和制备：以L-苯丙氨酸、L-精氨酸为单体，采用原子转移自由基聚合法，选择适当的引发剂引发苯丙氨酸-亚酰胺（Phe-NCA）、二硝基苯基精氨酸-NCA（DNP-Arg-NCA）自聚，再经催化氢化法脱二硝基苯基而成聚苯丙氨酸-聚精氨酸两亲性嵌段共聚物（PPhe-PArg）。在室温下，用三光气法分别制备Phe-NCA、DNP-Arg-NCA，选择引发剂bipyNi(COD)引发原子转移自由基聚合Phe-NCA形成PPhe-Ni，再由PPhe-Ni引发DNP-Arg-NCA聚合成PPhe-P(DNP-Arg)，再脱二硝基苯基而成PPhe-PArg。通过控制反应的时间来控制聚合物的分子量分布；通过控制反应体系中引发剂与单体的比例来调整生成聚合物ML/MH。（2） 采用红外光谱、NMR、凝胶渗透色谱测定共聚物的化学组成、结构与分子量（或ML/MH）；液体表面张力计、荧光探针法、接触角测定仪和油水分配系数法表征共聚物的CMC及其疏水段的疏水性；zeta电位测定仪测定不同pH值溶液中共聚物的荷电量。（3） 以伊曲康唑和紫杉醇等不同性质的难溶性药为模型药物，采用微沉淀-自组装法制备以不同稳定剂稳定的纳米混悬剂。通过TEM、SEM表征纳米混悬剂的粒径、结构特征，用粒度测定仪、zeta电位测定仪等手段表征纳米混悬剂的粒径、荷电量，原子力显微镜（AFM）、差示扫描量热-失重分析（DSC-TG）、X-射线光电子能谱（XPS）等手段表征稳定剂对纳米粒的吸附力与吸附状态。以羟基喜树碱纳米混悬剂为研究对象，考察不同化学组成和结构的共聚物及溶液pH值对纳米混悬剂物理稳定性的影响；同时以与纳米药物具有强相互作用的共聚物为稳定剂，考察药物性质对纳米混悬剂物理稳定性的影响。其中物理稳定性的评价可以通过加速试验和长期试验，研究纳米混悬剂的物理稳定性。稳定性研究过程中，肉眼观察纳米混悬剂的外观变化；借助光学显微镜观察纳米混悬剂内部个别微米级粒子的结晶尺度及形态变化；应用粒度测定仪定量研究纳米混悬剂的粒度分布变化，如不同温度、湿度及pH环境贮存时粒度分布变化；并采用小杯法研究放置时间、温度、湿度及pH环境对药物释放速度的影响，高效液相色谱法研究在不同条件下药物的化学稳定性。（4） 选择共聚物的ML/MH、疏水段的疏水性、CMC及zeta电位等参数作为评价稳定剂性质的标准；同时查询或测定药物的氢键供体、氢键受体、熔点和油水分配系数等分子性质参数；以粒径变化规律、药物释放速率变化趋势和药物化学稳定性为桥梁，通过SPSS软件建立稳定剂性能参数、药物性质参数与纳米粒稳定性之间的定性关系，同时以纳米粒和稳定剂的吸附力为纽带，由SPSS软件确定稳定剂性能参数、药物性质及zeta电位与纳米混悬剂的粒度分布变化率和药物释放速率之间的定量关系。（5） 以羟基喜树碱为模型药物，优选一种理想的共聚物，通过叶酸活性酯与共聚物中聚精氨酸段上的呱基反应，将叶酸与共聚物偶联，获得靶向修饰的共聚物材料。采用微沉淀-自组装技术制备纳米混悬剂，并采用TEM、SEM、粒度测定仪、zeta电位测定仪、AFM、DSC、XPS等技术进行制剂学和稳定作用力表征。运用敏感肿瘤细胞珠（如MCF-7）和多药耐药细胞株（如MCF-7/Adr）进行体外细胞摄取和抗肿瘤活性实验，研究其药物外排抑制作用。最后采用裸鼠在体肿瘤组织分布实验和荧光示踪技术研究其靶向性。本项目分三年完成，具体的年度研究计划及预测进展如下：（1） 2013年1月2013年12月：进行文献调研，原材料准备。开展PAA-ABC的制备、表征，优化制备条件，调控PAA-ABC的化学组成和结构。（2） 2014年1月2014年12月：开始纳米混悬剂的制备及制剂学性质的评价。总结前期成果，分析聚合物化学组成和结构、药物性质纳米粒稳定性的定性定量关系。期间拟参加国际或国内学术会议一次，并邀请国内同行专家进行学术交流一次。（3） 2015年1月2015年12月：制备促透性靶向纳米晶给药体系，评价其制剂学性质、抑制药物外排作用和特定组织靶向性。四、项目经费预算及用途序号经费科目经费预算（元）预算依据12345678合 计（元）五、预期成果（包括成果形式、数量、水平及效益）(1) 预期该项目完成后，制备出3-4种结构新颖、生物相容性好和稳定作用强的PAA-ABC，掌握PAA-ABC的制备、结构调控方法，理清PAA-ABC的化学组成、结构与其疏水亲和力之间的关系。(2) 建立PAA-ABC的化学组成、结构与纳米混悬剂稳定性之间的关系，制备出促透性靶向纳米晶给药体系，实现纳米混悬剂的多功能化；(3) 可在国内、外有影响的杂志上发表学术论文57篇，其中SCI至少3-5篇；申报国家发明专利1-2项；培养3-5名硕士研究生。六、指导教师意见 指导签字： 年 月 日七、学院意见 学院主管领导签字： 年 月 日 学院盖章：八、学校评审专家组意见组长签字： 年 月 日九、学校创新性实验计划领导组意见领导签字： 年 月 日 盖章：