大鼠灌注固定取脑.doc

大鼠灌注固定取脑窗体顶端窗体底端具体方法：1. 配4多聚甲醛PBS缓冲液。配法：称取40g PFA溶于装有900ml PB或PBS的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至6065，搅拌子速度从低到高，慢慢增加，至充分溶解。定容至1000ml，边搅拌边滴加1.0mol/L的NaOH直至7.0，过滤后室温或4保存备用。 2. 制作灌注装置，一瓶生理盐水，一瓶灌入多聚甲醛，悬挂，输液器链接，远端结一个三通后到一个输液器粗针头端。 3. 经心脏行灌注固定：麻醉，充分显露心脏（插针）和肝脏（判断），尽可能多暴露心脏，利于操作。首先快速滴入生理盐水或PBS，用止血钳（选把好的很关键）预夹住心尖少部，持针从心尖略偏左下进，插入有突破感即停（小鼠室壁厚约1mm），大头针或止血钳固定，若正确进入，右房充盈，剪破右房，此时液体较快下滴（调整针头朝向），红色血液从右房流出，快速冲尽全身血液（否则影响免疫反应），时间约45min，约40ml/只小鼠，80ml/只大鼠（取水冲洗切口，防血液凝固）。流出液变白即可，盐水过多细胞死亡多。正确的标志：右房充盈（但不是迅速充盈），肝脏逐渐变白，口鼻干燥。再注入4%多聚甲醛灌注30min左右，多聚甲醛要偏快，100ml/只小鼠，200ml/只大鼠。大鼠不建议用灌注机（先排空管中空气，再行灌注。）它的灌流速度达不到。灌注正确标准： 换多聚甲醛后身体反应，尤其尾巴竖起、四肢伸直变硬。PBS或NS灌流时，血流丰富的脏器如肝脾肾等的颜色会迅速转为灰白，此为灌流正常；另外，大鼠耳尖，口唇，四肢掌部也会变苍白。4.取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边的顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。灌注成功则脑变白，无红色血管。5. 最后在同样固定液中4固定12小时（包新民做的是一周），沉糖切片。有几点体会 ：4多聚甲醛的配制：加热至6065固然融解的快，不过容易挥发，气味难闻，不是好的选者。在此强烈推荐：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。 灌注时夹上腹主动脉只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。 灌注时注意排空输液管中的气泡不然容易气栓，影响灌注效果。一定要看到大鼠较剧烈抽搐，不然证明灌注不好。 个人体会：1、多聚甲醛加热溶解很快，只需要15分钟左右，需配置的量比较大的时候是较合适的方法。如果有通风厨的可在通风厨内配置。在通风较好的地方配置也可以，但配置的时候配溶液的人一定要注意自我防护，味道确实很刺激！2、开胸时不要伤到心脏。3、心脏穿刺最好用留置针，软，不宜穿通室间隔,见血即退针芯。插针部位是心尖部，方向向中线（先主动脉插管，再右心耳放血，这样插管容易些。先剪右心耳的话，心脏会瘪下去的）。4、生理盐水冲血管,到右心耳流出无色液体。5、多基甲醛固定成功的表现是刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后老鼠后肢绷直，尾部竖起成一直线；所灌注的脑组织白而硬。5、根据你实验设计，,需要切片的部位，有重点的取，常见的体表标志是前囟和外耳道。6、去颅骨后脑表面有一层硬脑膜，要去掉。 7、后固定：灌流后的脑组织置于4PFA置4度冰箱内进行后固定，时间2h，过夜最好。 恒流泵的方法在心尖搏动明显的部位，朝向主动脉插入灌流针即从心尖插入灌流针，通过左心室直至主动脉；打开腹腔，结扎腹主动脉；剪开右心耳，插人聚乙烯管，用以液体回流。打开恒流泵以10 ml/min的速度开始从心脏灌注温生理盐水，以清除血液，并开始计时，直至回流管流出晶莹明亮的液体，记录时间和生理盐水的使用量。然后用4 % 多聚甲醛以5ml/min的速度灌流15min，并分别在第5 min 、第10 min、第15min夹闭前腔静脉，暂停灌流1 min，让固定液在大鼠的脑组织中充分作用；最后打开颅腔，切取其脑组织，并置于固定剂(4 % 多聚甲醛和30 % 蔗糖溶液) 中，4 保存直至切片。所获得的脑组织呈乳白色，质地较硬，且所需灌注时间和生理盐水使用量均为最少。