鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程（定稿）

ICS11.220B 41DB37山东省地方标准DB37/T 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程Diagnostic techniques for Riemerella Anatipestifer infection-发布-实施山东省市场监督管理局 发布DB37/T 前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院家禽研究所、山东省动物疫病预防与控制中心、威海市畜牧业发展中心、临沂市畜牧发展促进中心。本标准主要起草人：黄兵、李玉峰、马秀丽、于可响、宋敏训、赵国清、秦卓明、刘存霞、林树乾、陈静、谭善杰、郭效珍、赵巧雅。11鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程1 范围本标准规定了鸭疫里默氏杆菌病的临床诊断、细菌分离、病原核酸检测和综合判定的技术要求。本标准适用于鸭疫里默氏杆菌病的诊断与检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 临床诊断3.1 流行病学该病一年四季均可发生，鸭、鹅、野生水禽和火鸡均可发病，1周龄8周龄鸭高度敏感，5周龄以下死亡较快，较大的鸭可能存活时间较长，该病在种鸭中少见。3.2 临床症状3.2.1 最急性型很少出现明显症状即突然死亡。3.2.2 急性型常见于2周龄3周龄的雏鸭，病程1日3日。患鸭精神沉郁、嗜睡、厌食、离群、不愿走动或行动迟缓，眼鼻分泌物增多，患鸭呼吸困难、缩颈或以喙抵地，濒死期出现神经症状呈角弓反张、抽搐等。3.2.3 慢性型常见于4周龄7周龄鸭，病程可达一周以上。主要表现为精神沉郁、厌食、腿软弱无力、不愿走动、伏卧或呈犬坐姿势，共济失调、痉挛性点头或头左右摇摆，难以维持躯体平衡，部分病例头颈歪斜，当遇到惊扰时呈转圈运动或倒退，部分患鸭跛行。感染后存活的鸭往往生长迟缓。3.3 病理变化特征性病变为病死鸭浆膜出现广泛性的纤维素性渗出，包括心包炎、气囊炎和肝周炎。慢性病例可见脑炎。3.4 判定标准若发病鸭符合3.1流行病学特征、3.2临床症状和3.3病理变化，可判为鸭疫里默氏杆菌病疑似病例，应进行细菌分离和核酸检测确诊。4 实验室诊断除非另有规定，实验室诊断所用化学试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T 6682二级水的规定；实验室生物安全要求按照GB 19489执行。4.1 细菌分离4.1.1 仪器和设备4.1.1.1 生物安全柜。4.1.1.2 CO2培养箱。4.1.1.3 显微镜。4.1.2 试剂或材料4.1.2.1 血清琼脂平板（见附录A.1）。4.1.2.2 麦康凯琼脂平板（见附录A.2）。4.1.2.3 革兰氏染色液。4.1.2.4 瑞氏染色液。4.1.3 操作步骤4.1.3.1 取样按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的肝脏或脑（有典型纤维素性渗出时采集肝脏，有神经症状时采集脑）。4.1.3.2 分离培养将接种环伸入组织内部，然后划线接种于血清琼脂平板和麦康凯琼脂平板，平板的配制根据根据GB4789.28的规定进行操作，含5%10% CO2 的37 培养箱或烛缸中培养24 h48 h。挑取符合4.1.3.3描述的典型菌落，划线接种于血清琼脂平板进行纯化培养。4.1.3.3 菌落形态在血清琼脂平板培养基上见有湿润、呈露滴样、圆形隆起、表面光滑、边缘整齐的菌落，直径为1mm2 mm，颜色为灰白色；而麦康凯琼脂平板上无菌落生长。挑选单个典型菌落进行革兰氏染色和瑞氏染色，并镜检。革兰氏阴性，为无鞭毛、不运动、不形成芽胞的小杆菌。单个、成双或呈短链状排列，菌体形态除杆状外，部分呈椭圆形，偶见呈长丝状。细菌大小宽为0.2 m0.5 m，长为1 m5 m，呈丝状的菌体可长达11 m24 m。瑞氏染色可见大多数菌体呈两极着染。4.1.4 结果判定分离的细菌如同时符合4.1.3.3和4.1.3.4，可判定为疑似鸭疫里默氏杆菌。4.2 病原核酸检测4.2.1 PCR方法4.2.1.1 仪器和设备4.2.1.1.1 高速冷冻离心机。4.2.1.1.2 PCR扩增仪。4.2.1.1.3 电泳仪。4.2.1.1.4 紫外分析仪。4.2.1.1.5 微量加样器：0.5 L10 L；2 L20 L；20 L200 L；100 L1 000 L。4.2.1.2 试剂或材料4.2.1.2.1 阴性质控。4.2.1.2.2 阳性质控（灭活细菌培养物）。4.2.1.2.3 蛋白酶K。4.2.1.2.4 PBS（附录B.1）。4.2.1.2.5 TE（附录B.2）。4.2.1.2.6 SDS（附录B.3）。4.2.1.2.7 琼脂糖凝胶（附录B.4）。4.2.1.2.8 TAE电泳液（附录B.5）。4.2.1.3 样品处理及核酸提取4.2.1.3.1 组织样品无菌取疑似鸭疫里默氏杆菌病的肝脏、脾脏等脏器组织1.0 g5.0 g，按10%（g/mL）加入PBS，研磨匀浆。-20 保存备用。取100 L组织匀浆液加入400 L TE中充分混匀，再加终浓度为1%的SDS和100 g/mL的蛋白酶K，置56 水浴消化2 h，冷至室温后用酚及氯仿各抽提两次，无水乙醇沉淀，75%乙醇洗涤，最后用40 L DEPC水溶解DNA，作为PCR模板，或保存于-20 。或者用商品化的DNA提取试剂盒提取DNA。4.2.1.3.2 菌落样品挑取4.1.3.2可疑菌落，加到含20 L灭菌去离子水的PCR离心管中，压紧管盖，煮沸10 min，再冰浴10 min后离心取上清作为PCR模板样品。或者用商品化的DNA提取试剂盒提取DNA。4.2.1.4 引物根据GenBank中发表的鸭疫里黙氏杆菌16s RNA基因序列设计引物，扩增片段大小为475 bp。上游引物RA-001F:5-TTA GAT AGT TGG TGA GGT AA-3。下游引物RA-002R:5-ATC GGT GTT CTG AGT AAT-3。4.2.1.5 PCR扩增4.2.1.5.1 反应体系反应体系为25 L，配制见表1。表1 PCR反应体系配制PCR反应体系中各成分每个样品反应组分用量/L10PCR buffer2.52.5 mmol/L dNTP2.010 mol/L引物F0.510 mol/L引物R0.55 U/L Taq E0.5模板1.0无RNA酶去离子水18.0总体积25.04.2.1.5.2 反应程序采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段：95 5 min； 第二阶段：95 30 s，56 30 s，72 40 s，共进行30个循环； 第三阶段：72 10 min。PCR扩增也可使用商品化的PCR试剂盒，按说明书要求操作。4.2.1.5.3 电泳反应结束后取10.0 L PCR产物与1.0 L 10上样缓冲液混合，加到1%琼脂糖凝胶板的加样孔中，同时设DNA分子量标准参照，以5 V/cm电压进行电泳20 min40 min，在凝胶成像仪上观察结果。4.2.1.6 结果判定4.2.1.6.1 试验成立的条件在阳性质控出现一条大小475 bp的单一条带，同时阴性质控无此条带的情况下，检测结果成立。4.2.1.6.2 结果的判定被检样品出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阳性；被检样品未出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阴性。如果阴、阳性质控结果不成立，则全部样品应该重做。参见附录C。4.2.2 实时荧光定量PCR方法4.2.2.1 仪器和设备4.2.2.1.1 实时荧光定量PCR检测仪。4.2.2.1.2 台式高速冷冻离心机。4.2.2.1.3 涡旋振荡器。4.2.2.1.4 可调移液器：0.5 L10 L；2 L20 L；20 L200 L；100 L1 000 L。4.2.2.1.5 无RNA酶的荧光定量PCR管。4.2.2.2 试剂或材料4.2.2.2.1 阴性质控。4.2.2.2.2 阳性质控（灭活细菌培养物）。4.2.2.2.3 蛋白酶K。4.2.2.2.4 SDS。4.2.2.2.5 实时荧光定量PCR试剂盒。4.2.2.3 样品处理及核酸提取4.2.2.3.1 组织样品参见4.2.1.3.1。4.2.2.3.2 菌落样品参见4.2.1.3.2。4.2.2.4 引物根据GenBank中发表的鸭疫里黙氏杆菌16s RNA基因序列设计引物，扩增片段大小为190 bp。上游引物RA-003F:5-GCT GGA ATG AGT AGT GTA G-3。下游引物RA-004R:5-GCT TAG TCT CTG AAC CAT ATA G-3。4.2.2.5 荧光定量PCR4.2.2.5.1 反应体系采用20 L反应体系，组成见表2。表2 荧光PCR反应体系配制反应体系中各成分每个样品反应组分用量/L2SYBR Premix10.010 mol/L引物P31.010 mol/L引物P41.0模板2.0无RNA酶去离子水6.0总体积20.04.2.2.5.2 反应程序采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段：95 2 min； 第二阶段：95 20 s，57 1 min，共进行40个循环，57 时收集荧光。反应结束后根据分析软件得出的Ct值和扩增曲线来判定结果。4.2.2.5.3 结果判定4.2.2.5.3.1 试验成立的条件阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。阴性质控的检测结果应无特异性扩增；阳性质控的Ct值应28.0，则试验成立。4.2.2.5.3.2 结果的判定当被检样品Ct值30且出现典型扩增曲线时，判为阳性；当被检样品无Ct值或者Ct值35时，判为阴性；当被检样品在30Ct值35时判为可疑，需重做，再次检测结果的Ct值35，且出现典型扩增曲线，则可判为阳性，否则判为阴性。结果判定见附录E。5 综合判定符合3.4临床诊断规定的疑似病例经4.2.1和4.2.2中的任一方法检测，结果为阳性者，可判定为鸭疫里默氏杆菌病。AA附录A （规范性附录）试剂的配制A.1 PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）氯化钠8.00 g氯化钾0.2 mL磷酸二氢钾0.2 mL磷酸氢二钠2.89 g硫柳汞0.1 g去离子水加至1000 mL100 kPa 15 min灭菌，置4 冰箱保存备用。A.2 10 TE羟基甲基氨基甲烷（Tris）12.11 g乙二胺四乙酸二钠3.72 g水800 mLHCl调PH 至8.0水加至1000 mL100 kPa 15 min灭菌后备用。A.3 20% SDS十二烷基硫酸钠20 g水80 mLHCl调PH 至7.2水加至100 mLA.4 1.0% 琼脂糖凝胶琼脂糖1.0 g1TAE电泳缓冲液加至100 mL加热完全融化，待冷至50 60 时，加Goodview溶液5 L，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。A.5 50TAE 缓冲液羟基甲基氨基甲烷（Tris）242.0 g冰乙酸57.1 mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（PH 8.0）27.5 mL灭菌去离子水加至1000 mL2 8 保存。BB附录B （规范性附录）培养基的配制B.1 血清培养基琼脂牛肉膏0.5 g蛋白胨1.0 g氯化钠0.5 g琼脂粉1.0 g去离子水加至100 mL，100 kPa 20 min灭菌，待冷却到50 60 时加入5 mL无菌鸡血清。置4 冰箱保存备用。B.2 麦康凯培养基麦康凯粉末50 g琼脂粉10 g去离子水加至1000 mL，100 kPa 15 min灭菌，置2 8 冰箱保存备用。CC附录C （资料性附录）PCR结果电泳图说明：1阳性质控；2阴性质控；3空白对照；MDL2000 DNA分子量标准。图C.1 PCR结果电泳图DD附录D （规范性附录）荧光定量PCR扩增示意图说明：1阳性质控；2阴性质控；3空白对照。图D.1 荧光定量PCR扩增示意图_