过氧化物酶(POD)同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳.doc

过氧化物酶(POD)同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳一、目的1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程。3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程。二、实验原理：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及影响电泳的主要因素带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。带电离子在电场中的泳动速度（1）和迁移率（泳动度）（2）V=Eqa(1)6ru=qa(2)6r由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。另外，迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。一般最适的离子强度在0.010.1mol/L之间。最常见的为0.05。在稀溶液中，离子强度可用下式计算：1/2miZi2 (3)（3)式中，mi为离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数。（1）式中泳动速度V除了上述影响因素外，还与电场强度E成正比。2、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。化学聚合的引发剂是过硫酸铵 (NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N,N-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。冷却可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。光聚合以光敏感物核黄素（即VB2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100mL凝胶溶液中含有的单体（Acr）和交联剂（Bis）总克数称为凝胶浓度，用T表示。凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体（Acr）和交联剂（Bis）总量的百分数称为交联度，用C表示。改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。一般常用7.5浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用2.4%的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同（见表1）。表1 凝 胶 浓 度 选 用 表物 质分 子 量 范 围适用的凝胶浓度(%)蛋 白 质 104 2030 11044104 1520 41041105 1015 11055105 510 5105 25核 酸 104 1520 104105 510 1052106 22.63、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理系统的不连续性表现在以下几个方面：（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。浓缩胶：又称堆积胶。凝胶浓度较小，孔径相对较大。把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用样品被浓缩成一个狭窄的区带，使样品组分在分离胶中得以高分辨率的被分离。分离胶:又称电泳胶，通常孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，使样品组分得以很好地分离。分离胶又分为均一胶和梯度胶。（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。（3）在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。下面以本实验要分离的豆芽或土豆过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的性质及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下： 由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。 在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，迁移率最大的Cl迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7条件下解离度仅有0.11的甘氨酸（pI = 6.0 ）迁移率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其迁移率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系：VI/S (4)所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，迁移率迅速加大，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。4、过氧化物酶同工酶电泳同工酶是指其催化的化学反应相同，而酶的结构、理化性质乃至免疫性质不同的一组酶。植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离、鉴定土豆、豆芽过氧化物酶同工酶。同工酶染色：根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带。过氧化物酶能催化过氧化氢使联苯胺氧化成蓝色或棕色产物，据此即可将该酶在凝胶中显色定位。三、实验材料、仪器与试剂1、材料土豆和豆芽2、仪器：DYCZ-24E电泳槽、DYY-11型和DYY-12型三恒多用电泳仪、台式高速离心机、微量进样器、芬兰可调移液器，研钵，50mL烧杯，量筒、大培养皿等玻璃器皿。3、试剂：电泳试剂贮存液配置见附表(附表1)。染色液成分：抗坏血酸70.4mg,联苯胺溶液(2g联苯胺溶于18mL温热冰醋酸中,再加入蒸馏水72mL)20mL,0.6%(或1.2%)过氧化氢20mL,蒸馏水60mL。四、实验步骤：1.安装制胶模具（教师演示，学生安装）注意事项：在整个过程中要轻拿轻放，以免将玻璃板弄碎。2.制作分离胶(浓度10%)分离胶配方(浓度10%):pH8.9 Tris-HCl溶液:0.8mL 分离胶PAG溶液:1.2mL 蒸馏水:1.6mL 10%TEMED:40l 10%AP: 40l将上述溶液充分混匀,立即全部倒入安装好的制胶玻板中,为使分离胶界面平整,可在倒入分离胶后约5min后在其表面沿高板缓慢均匀加入0.5mL蒸馏水并将电泳槽轻轻敲击桌面。再静置40min左右,让分离胶凝聚完全。3.制作浓缩胶(浓度2.4%)浓缩胶配方(浓度2.4%):pH6.7 Tris-HCl溶液:0.42 mL 浓缩胶PAG溶液:1.25mL 40%蔗糖溶液:1.25mL 10%TEMED:30l 10%AP: 30l将上述溶液充分混匀,在聚合完全的分离胶上,倒入浓缩胶,（注意在倒入浓缩胶前要去掉分离胶表层的水）同时插入梳子,直到溶液装满和梳子插平为止。再静置40min左右,浓缩胶聚合完全后为乳白色。注意事项：A、在整个过程中要将制胶模具垂直放在桌面上，不容许倾斜。B、充分混匀的（分离胶或浓缩胶）溶液应尽快用移液枪延高板的一侧慢慢加入胶板中C、胶制作完成后，松开卡板取下橡胶皮，然后再用卡板卡紧胶板。要注意低板在内侧。4.制样取适量(2g)的马铃薯于研钵中,加1mL的PBS(磷酸缓冲液,pH7.4),于冰上研磨至匀浆状,收集在1.5mL的离心管中,在台式离心机中以8000rpm离心5min，取上清,即为粗酶提取液,其中含有所需的POD。另外,豆芽研磨可取4g左右,同样加入1mL的PBS。5.点样在浓缩胶聚合完毕后,小心取出梳子,两拇指和食指捏住梳子的柄,其余三指顶住制胶框两侧,匀速地拔出梳子,然后向电泳槽中倒入预冷的电极缓冲液（原液要稀释10倍）,缓冲液要没过低板。点样前,要对样品进行预处理,即把粗酶提取液与甘油溴酚蓝指示剂以4:1混合,用50l的微量点样器吸取样品20l,将点样器的针头小心插入到点样孔底部,慢慢注入样品,要注意防止漂样。6.电泳点样完毕后,连接好导线(正负电极不要接反,红色为正极,黑色为负极),将电压调至70 V,当溴酚蓝标志线移至浓缩胶与分离胶分界处,将电压调至150V,电泳2-3小时,当溴酚蓝标志线刚好跑出胶板时,结束电泳。7.取胶切断电源,取出缓冲液并低温保存,可重复使用2次。然后松开卡板，取出凝胶板,用解剖刀扁平部分插入玻板的一角(是分离胶的一角),轻轻撬去一块玻板,用刀切掉分离胶右下角以示点样顺序,轻轻撬起分离胶,使之滚入染色培养皿中。8.染色POD染色步骤如下：先用自来水溶液润洗两遍,再加入30-40mL的染色液,室温下放置5-20min,至显色完全。9.清洗玻璃板、胶皮、电泳槽。五、注意事项：1.在整个清洗过程中要轻拿轻放，以免将玻璃板弄碎。同时，清洗玻璃板不容许用强酸、强碱以及酒精溶液，一般用清水加一点洗涤剂进行清洗，然后用去离子水或蒸馏水润洗。2.在整个实验过程中，要注意实验安全，凝胶、联苯胺等试剂有毒，应戴乳胶手套或一次性手套操作。3.在电泳过程中不允许用手去触摸电极缓冲液，以免触电。附表1试剂 配方分离胶PAG溶液 丙烯酰胺 (Acr):30g N,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis):0.8g 加水定容至100mLTris-HCl缓冲液(pH8.9) Tris:36g HCl(12mol/L):2mL 加水定容至100mL浓缩胶PAG溶液 Acr:5.0g Bis:1.25g 加水定容至50mLTris-HCl缓冲液(pH6.7) Tris:3g HCl(12mol/L):2mL 加水定容至50mL 40%蔗糖溶液 蔗糖:20g 加水定容至50mL10% TEMED 溶液 四甲基乙二胺(TEMED):10mL 加水定容至100mL(避光、低温保存)10%过硫酸胺(AP)溶液 AP:0.5g H2O:5mL (避光、低温保存,一周内可多次使用)甘油溴酚蓝指示剂 溴酚蓝:0.01g H2O:5mL 甘油:5mL电极缓冲液(pH 8.3) Tris:6.0g 甘氨酸(Gly):28.8g 加水定容至1000mL,使用时稀释10倍0.2mol/L PBS溶液(pH7.8) 按照有关参考书配置