《芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法》编制说明

芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法国家标准编制说明1任务来源12起草的目的意义12.1企业产品质量控制的需要12.2完善国家标准的需要23芒果苷研究、应用与标准现状23.1芒果苷研究23.2芒果苷开发应用23.3芒果苷标准24主要起草过程34.1成立标准制定工作组34.2确定工作计划和标准制定原则34.3查询国内外相关标准和文献资料34.4 研究建立标准方法，开展条件实验44.5方法验证64.6形成标准讨论稿和编制说明64.7形成标准草案64.8形成标准征求意见稿和编制说明74.9征求意见并形成标准送审稿和编制说明75 本标准与国内外分析方法的关系76 主要技术指标依据与说明86.1标准名称86.2前言86.3主体内容86.4“范围”的界定86.5原理86.6试剂86.7仪器和设备96.8芒果叶样品制备106.9样品中芒果苷的提取106.9.1 提取溶剂比例106.9.2超声时间116.9.3 提取溶剂体积116.9.4 提取次数126.10 芒果苷HPLC定量分析方法的建立136.10.1检测波长选择136.10.2 色谱柱的选择156.10.3不同洗脱条件156.10.3.1等度洗脱156.10.3.2梯度洗脱166.10.4芒果苷HPLC法检测优化后的色谱条件176.10.5 标准曲线186.10.6 检出限和定量限186.10.7 精密度196.10.8 稳定性196.10.9 重复性206.10.10方法的准确度206.10.11小结226.11 方法验证226.11.1 参加验证的实验室226.11.2 方法验证结果226.12实际样品检测286.13验证结论297采用国际标准和国外先进标准程度，以及与国际、国外同类标准水平的对比情况318与现行法律法规和强制性标准的关系319标准作为强制性或推荐性标准的意见3110实施标准的建议3111参考文献31II1任务来源 本国家标准的制定任务是根据国家标准化管理委员会下达的国家标准制定计划芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法项目（计划号20193347-T-424）起草。国家标准计划芒果叶中芒果苷的测定 高效液相色谱法由424-cnis（中国标准化研究院）归口上报及执行，主管部门为国家市场监督管理总局(质检)。本标准由中国热带农业科学院分析测试中心和中国标准化研究院共同起草。本标准主要起草人：阳辛凤，兰韬，席兴军，韩丙军，赵方方，张月，郭晓杰，王盼，唐涛。2起草的目的意义芒果树（Mangifera indica L.）属于漆树科植物，其叶片芒果叶为广西等地方习用药材, 收载于广西中药材标准 1990年版。芒果叶及芒果叶提取物等制品的主要活性成分为芒果苷(Mangiferin，CAS 4773-96-0)，此外，芒果苷是百合科植物知母根茎、龙胆科植物藏茵陈等中药材的主要活性成分。药理研究表明, 芒果苷具有多种药理活性, 如镇咳、杀菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂等。芒果苷为2015年版中国药典规定的知母等中药材鉴别和质量控制的重要检测指标。对于芒果叶及芒果叶提取物等加工产品，芒果苷含量水平是重要的质量指标。2.1企业产品质量控制的需要目前，市面上含有芒果苷的药品有芒果止咳片（广西中医药大学制药厂、广西桂西制药有限公司）、银花芒果片（广西南珠制药有限公司）、银花芒果胶囊（广西宝瑞坦制药有限公司）等。我国海南、广西、云南、四川等省均有产业化的芒果栽培（例如2017年海南省芒果面积达到38万亩，产值3个亿），每年产生大量的芒果叶废弃物。同时，以芒果叶为原料生产芒果叶提取物/干浸膏和复方药品的规模不断扩大。但是，芒果苷含量测定尚无国家标准, 且对芒果苷原料药的提取工艺不同, 导致原料药质量标准不统一, 药品临床疗效不稳定。因此，本标准的制定是企业进行产品质量控制的需要。2.2完善国家标准的需要我国现行检测方法标准中，尚无芒果苷检测方法标准。为了贯彻落实国务院办公厅关于促进热带作物产业发展的意见（国办发201045号）文件精神，科学指导芒果叶生产、加工产业的发展，急需制定芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法国家标准，建立芒果叶中芒果苷含量检测标准，为芒果苷原料药的质量控制提供方法，为芒果苷产品研发及芒果叶综合开发利用提供依据，进而引导生产，规范市场。所以，本标准的制定也是完善芒果叶等中药材及其加工产品检测方法国家标准的需要。3芒果苷研究、应用与标准现状3.1芒果苷研究国内外对芒果苷的研究十分广泛，可查询到大量的论文与专利，研究范围包括提取分离、纯品制备、分析检测、结构表征、药理活性、毒性、分子结构改性、产品加工等方面。3.2芒果苷开发应用以芒果苷为活性成分的加工产品有芒果叶提取物、干浸膏、复方中成药等。成都德思特生物技术有限公司、四川省维克奇生物科技有限公司、成都植标化纯生物技术有限公司、陕西斯诺特生物技术有限公司、青岛捷世康生物科技有限公司等众多公司均生产芒果叶提取物、芒果叶干浸膏、高纯芒果苷。广西中医药大学制药厂、广西桂西制药有限公司、广西南珠制药有限公司、广西宝瑞坦制药有限公司生产含有芒果叶干浸膏的复方药品，例如芒果止咳片、银花芒果片、银花芒果胶囊，均为国药准字药品。总的说来，芒果苷的开发利用尚处于初级发展阶段，虽然有干浸膏、复方中成药等几种类型的产品，但还没有形成规模化。3.3芒果苷标准 可查询到已废止的芒果苷地方标准一项，地方标准芒果苷（DB45/T 512-2008，已废止），该标准由广西中医学院归口上报，主管部门为广西壮族自治区质量技术监督局，主要起草单位为广西中医学院，公布日期2008-07-28，实施日期2008-08-28。此外，未查到与芒果苷相关的国家标准、行业标准、地方标准和企业标准。芒果苷分析方法标准的缺失，使得相关企业在市场竞争中无标准可用，相关产品缺乏技术支撑，质量参差不齐。因此，有必要尽快制定芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法国家标准，以满足相关企业和检测、管理结构的需要。4主要起草过程4.1成立标准制定工作组国家重点研发项目立项后，2017年11月10日在北京市西藏大厦召开了国家标准芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法第一次工作会。参加单位有中国热带农业科学院、中国标准化研究院等。会议成立了由国热带农业科学院、中国标准化研究院等单位参加的标准工作组，主要由从事标准制修订、仪器分析、具有丰富技术经验的专业研究人员组成，工作组制定了初步的标准编制工作计划。4.2确定工作计划和标准制定原则按照工作任务要求，工作组制定了标准起草工作计划和任务分工。在充分研究与讨论的基础上，制定了标准制定原则：（1）先进性：其准确度、精密度和灵敏度达到较高水平。（2）适用性：要适应我国中药产业发展的要求，满足中药现代化的需要。（3）可操作性：符合我国目前检测仪器设备和试剂、材料的供应条件。（4）实用性：符合检测从业人员的技术水平，能被国内主要的环境分析实验室所使用并达到所规定的要求。要有利于提高芒果叶及其制品质量，为中药质量控制部门、有关企业和三农服务。4.3查询国内外相关标准和文献资料2017年，开始开展“芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法”方法研究。由于在现行国家标准、行业标准、地方标准、团体标准和企业标准中，均无相应的测定方法标准，所以我们查阅相关文献并开展研究工作。分析芒果苷的结构特点，芒果苷具有双苯吡酮结构，在258nm、317nm、368nm具有特征吸收。中国药典2015年版中，有“知母”条目，芒果苷为知母鉴别和质量控制的重要检测指标，知母中芒果苷的含量测定时采用液相色谱法。该方法的要点有：（1）以稀乙醇为芒果苷提取溶剂，（2）通过超声进行辅助提取，（3）采用C18色谱柱，（4）检测波长258nm，（5）流动相为乙腈-0.2%冰醋酸水溶液（15 : 85)。中国知网、万方等中文数据库中查询到的公开发表文献中，关于芒果叶中芒果苷的测定几乎都是依据或参考中国药典2015年版规定的方法。通过对SpringerLink、Elsevier ScienceDirect(SD)、Wiley等国外数据库检索到少量以液相色谱-串联质谱法对芒果苷进行检测。液相色谱法检测芒果苷具有准确度好、精密度高、检出限与定量限低、操作简单等优点，考虑到标准的适用性与可操作性，因此确定采用液相色谱法检测样品中芒果苷。借鉴中国药典2015年版知母中芒果苷含量测定的方法，以芒果叶为样品，经过初步试验，证明方法是可行的。而后对方法进行优化，对方法进行验证，结果表明方法的准确性、回收率、精密度等方面都能达到国家可标准的要求，并且基本符合制定国家标准的条件，并于2018年向国家标准化管理委员会提出立项申请。4.4 研究建立标准方法，开展条件实验标准工作组按照计划任务书的要求，结合制定标准的要求，研究建立标准方法的实验方案，并进行方法前处理条件的选择、仪器条件的确定和方法精密度、准确度及检出限的测定等试验。2017年11月始，标准起草工作组赴海南省东方市、三亚市等芒果主产地进行调研，获取了大量相关信息与数据。2017年11月27日从东方广坝农场采集了24份芒果叶样品（表1），其中台农、贵妃、金煌叶片各8份。2019年2月27日从三亚闽新农场等采集芒果也样品20份（表2），其中台农、贵妃、金煌、象牙叶片各5份表1 芒果叶样品列表（1）序号品种样品编号采样地点采样时间1台农TN20171123-1东方广坝农场2017.11.272台农TN20171123-2东方广坝农场2017.11.273台农TN20171123-3东方广坝农场2017.11.274台农TN20171123-4东方广坝农场2017.11.275台农TN20171123-5东方广坝农场2017.11.276台农TN20171123-6东方广坝农场2017.11.277台农TN20171123-7东方广坝农场2017.11.278台农TN20171123-8东方广坝农场2017.11.279金煌JH20171123-1东方广坝农场2017.11.2710金煌JH20171123-2东方广坝农场2017.11.2711金煌JH20171123-3东方广坝农场2017.11.2712金煌JH20171123-4东方广坝农场2017.11.2713金煌JH20171123-5东方广坝农场2017.11.2714金煌JH20171123-6东方广坝农场2017.11.2715金煌JH20171123-7东方广坝农场2017.11.2716金煌JH20171123-8东方广坝农场2017.11.2717贵妃GF20171123-1东方广坝农场2017.11.2718贵妃GF20171123-2东方广坝农场2017.11.2719贵妃GF20171123-3东方广坝农场2017.11.2720贵妃GF20171123-4东方广坝农场2017.11.2721贵妃GF20171123-5东方广坝农场2017.11.2722贵妃GF20171123-6东方广坝农场2017.11.2723贵妃GF20171123-7东方广坝农场2017.11.2724贵妃GF20171123-8东方广坝农场2017.11.27表2 芒果叶样品列表（2）序号品种样品编号采样地点采样时间1象牙2019-01三亚北岭村大矛小组2019.2.272象牙2019-02三亚北岭村大矛小组2019.2.273象牙2019-03三亚北岭村大哺叭小组2019.2.274象牙2019-04三亚闽新农场2019.2.275象牙2019-05三亚闽新农场2019.2.276金煌2019-06三亚北岭村大矛小组2019.2.277金煌2019-07三亚北岭村大矛小组2019.2.278金煌2019-08三亚北岭村坝后小组2019.2.279金煌2019-09三亚南滨居南雅六队2019.2.2710金煌2019-10三亚南滨居闽新农场2019.2.2711贵妃2019-11三亚北岭村坝后小组2019.2.2712贵妃2019-12三亚南滨居南雅六队2019.2.2713贵妃2019-13三亚南滨居双联农场2019.2.2714贵妃2019-14三亚三公里鹿角园2019.2.2715贵妃2019-15三亚海棠村山地2019.2.2716台农2019-16三亚南滨居双联农场2019.2.2717台农2019-17三亚三公里山地2019.2.2718台农2019-18三亚三公里山地2019.2.2719台农2019-19三亚三公里鹿角园2019.2.2720台农2019-20三亚三公里鹿角园2019.2.27第一批样品采集后，开始开展实验室验证工作，建立芒果苷高效液相色谱分析方法，包括线性范围、相关系数、加标回收率、准确度、精密度、检出限、定量限等；样品中芒果苷提取条件的摸索与优化，如提取溶剂种类、提取溶剂体积、超声提取时间等。4.5方法验证2019年45月，由5家单位对“芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法”进行验证，分别是海南大学分析测试中心、海南省食品检验检测中心、海南省动物疫病预防控制中心、中国热带农业科学院环境与植物保护研究所、中国热带农业科学院分析测试中心，通过统计检验技术确认外部实验室试验结果的准确性。4.6形成标准讨论稿和编制说明2019年7月5日，起草工作组组织相关单位和专家，在山东青岛中国科学院兰州化学物理研究所召开第二次标准起草工作会。参会单位包括中国热带农业科学院、中国标准化研究院、中国科学院兰州化学物理研究所、北京化工大学、浙江大学等。与会专家对芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法标准草案中的英文名称、范围、术语和定义、基本要求、主要技术指标、附录等章条提出了详细的意见，会后根据修改意见形成了芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法标准讨论稿及其编制说明。4.7形成标准草案标准起草工作组查阅、收集和整理了国内外有关研究进展和专利、标准、法规等文献资料，掌握了相关标准的现状；对文献中芒果苷测定方法进行了对比和总结，为标准文本的编制奠定理论基础。在芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法国家标准第一次起草工作会议的基础上，起草工作组相关单位共同讨论起草形成了芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法国家标准的技术框架和主要内容，初步形成了芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法标准草案。4.8形成标准征求意见稿和编制说明在前期工作的基础上，起草工作组组织相关单位和专家于2019年10月22日在北京中国标准化研究院召开第三次标准起草工作会。参会单位包括中国热带农业科学院、中国标准化研究院、北京化工大学、浙江大学等。与会成员认真讨论芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法标准讨论稿后，根据讨论结果修改形成了芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法征求意见稿及编制说明。会议同时讨论了下一阶段征求意见的单位和专家名单。4.9征求意见并形成标准送审稿和编制说明2019年月日-2019年月日，起草工作组根据讨论的专家和单位名单，分别向相关的行业主管部门、科研机构、检测部门和企业等30个单位和专家发出了标准征求意见稿，向相关单位和专家征求标准修改意见。截止到2019年月日，共收集到农业部农产品质量监督检验测试中心（南宁）、等25家科研机构、检测机构、管理部门、生产企业等单位提出的反馈意见40条。起草工作组对提出的意见经过反复研究、讨论和处理后，修改形成了芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法送审稿及编制说明。具体意见汇总和处理表见芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法征求意见稿及编制说明。国家标准征求意见汇总处理表。5 本标准与国内外分析方法的关系本标准研究旨在建立一项满足我国常用中草药芒果叶中芒果苷含量检测要求，在质量控制目标和技术手段上与国际接轨，适应我国大部分中草药质控实验室仪器设备和技术能力的检测方法标准。通过查阅国内外相关文献资料，制定条件优化方案，确保本方法前处理所采用的装置操作简便，能够满足国内实验室的条件要求。本标准拟采用高效液相色谱-紫外检测分析方法（HPLC-UV）测定芒果苷。样品的前处理，即芒果叶中芒果苷的提取采用超声法，并对超声时间、提取溶剂种类、提取溶剂比例、提取次数等因素进行优化；检测方法参考中国药典2015年版关于知母药材种芒果苷的检测方法及其他文献资料，选择合适的色谱柱以及仪器条件。力求方法在稳定、可靠和实用的基础上，达到国际先进水平，以适应我国中草药芒果叶中芒果苷含量检测、质控与管理的需要。6主要技术指标依据与说明6.1标准名称本标准主要解决芒果叶中芒果苷测定的技术问题，所以将本标准的名称定为：芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法。本标准名称中芒果一词的英文，根据芒果的拉丁文名称、相关国家标准的翻译方式、行业内的通行用法确定为“Mangifera indica L.”。因此将本标准的全称芒果叶中芒果苷含量的测定 高效液相色谱法翻译为“Determination of mangiferin in mango (Mangifera indica L.) leaves high-performance liquid chromatorgraphy”。6.2前言明确了本标准的归口单位及主要起草单位、起草人。6.3主体内容标准的主体内容包括：范围、规范性引用文件、原理、试剂、仪器和设备、测定步骤、空白试验、结果计算与表示、精密度和回收率、检出限、检验报告等。6.4“范围”的界定本标准规定了用高效液相色谱-质谱法测定芒果叶中芒果苷含量的原理、材料、仪器与设备、测定步骤、结果计算与表示、精密度和回收率、检验报告。本标准适用于芒果叶中芒果苷含量的测定。6.5原理样品经提取后，将提取液过滤，经反向高效液相色谱分离测定，在258nm下检测，根据保留时间定性，外标峰面积定量。6.6试剂6.6.1 甲醇（CH4O）：色谱纯。6.6.2 乙腈（C2H3N）：色谱纯。6.6.3 冰醋酸（CH4O2）：优级纯，含量98.8%。6.6.4 甲醇溶液（50%）：甲醇与超纯水按照1:1体积比混合。6.6.5 冰醋酸溶液（0.2%）：1 L超纯水中加入2 mL冰醋酸。6.6.6 芒果苷（C19H18O11，CAS : 4773-96-0）标准品：纯度98%。6.6.7 有机滤模：孔径0.22m。6.6.8 流动相：乙腈（4.2）：冰醋酸溶液（4.5）=15:85（体积比），冰醋酸溶液使用前经滤膜过滤。6.6.9 芒果苷标准储备溶液（200 g/mL）：称取10 mg（精确至0.10mg）芒果苷标准品（4.6），置于50 mL容量瓶中（5.8），加甲醇（4.1）超声溶解并定容至刻度线，混匀，配制成200 g/mL的标准储备溶液，18冰箱避光保存，有效期3个月。6.6.10 芒果苷中间浓度标准溶液：准确移取5mL芒果苷标准储备溶液（4.9）于10mL容量瓶（5.8）中，用50%甲醇溶液（4.4）稀释至定容刻度线，摇匀，得到芒果苷中间浓度标准溶液（质量浓度100 g/mL）。6.6.11 芒果苷系列标准工作液：分别准确移取0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL芒果苷中间浓度标准溶液（4.10）于不同的10mL容量瓶（5.8）中，用50%甲醇溶液（4.4）稀释、定容刻度线，摇匀，得到芒果苷系列标准工作溶液（质量浓度分别为1g/mL、2g/mL、5g/mL、10g/mL、20g/mL）。6.6.12 除另外有规定外，所用试剂均为分析纯，水应复合GB/T6682中一级水的要求。6.7仪器和设备6.7.1 液相色谱仪：配紫外（UV）检测器或PDA检测器。6.7.2 超声波振荡器：功率不低于250 W，或相当的设备。6.7.3分析天平：根据方法准确度的要求，芒果苷对照品的称样量需精确到0.1 mg，因此使用感量为0.1 mg的分析天平6.7.3 电子天平：感量0.1 mg。6.7.4 组织捣碎机6.7.5涡旋振荡器6.10色谱柱：C18 液相色谱柱（250mm4.6mm，5m）或其他等效色谱柱。6.7.6针式微孔滤器：0.22 m，直径13 mm的聚四氟乙烯（PTFE）滤膜或者相当者。6.7.7 离心管：100 mL（螺旋盖）。6.7.8 容量瓶：10 mL，50 mL，100 mL6.7.9三角瓶：250 mL（磨口塞）。6.8芒果叶样品制备新鲜芒果树叶片，切碎，放入打浆机中打碎，装入样品瓶中，密封，于-20保存。6.9样品中芒果苷的提取6.9.1 提取溶剂比例称取芒果叶样品1.00g(精确至0.01g) 于100 mL离心管中。配置不同体积比的甲醇/水混合溶液（100/0、70/30、50/50、30/70）作为提取溶剂。离心管中加入提取溶剂50mL，高速匀浆1 min，将样品全部转移到250 mL具塞磨口三角瓶中。分别用40mL、30mL提取剂洗涤离心管和刀头共2次，溶液合并至三角瓶中。将三角瓶瓶塞盖上，放入超声清洗仪中，室温下超声提取30 min。取出，静置20min。将上清转入250 mL容量瓶中，样品残渣留在三角瓶中。三角瓶中加入提取溶剂100mL，超声30 min，进行二次提取。容量瓶上放置漏斗，放入脱脂棉，将样品提取液过滤，滤液合并至250mL容量瓶，用少量提取溶剂洗涤三角瓶内壁与漏斗内壁共3次，洗涤液合并至250mL容量瓶，用提取溶剂定容至250mL，摇匀，得到芒果叶样品提取液。用1.0 mL刻度玻璃移液管，吸取样品提取液1.0mL，放入100mL容量瓶中，用提取溶剂定容，0.22 m微孔滤膜过滤至样品瓶,供液相色谱分析。不同配比的甲醇/水提取溶剂对芒果苷提取率的影响，结果如图1 所示。当提取溶剂中甲醇/水比例为70/30（v/v）时，芒果苷提取率最高。图1 提取溶剂对芒果苷提取率的影响6.9.2超声时间称取芒果叶样品1.00g，放入250mL具塞锥形瓶中，以 70/30的甲醇/水混合溶液为提取溶剂，按照3.3.1进行芒果苷提取，其中超声提取时间分别采用10、20、30、40、50、60min。 不同的超声时间对芒果苷提取率的影响，结果如图2 所示。当超声时间为30min的甲醇/水溶液时，芒果苷提取率最高。图2 超声时间对芒果苷提取率的影响6.9.3 提取溶剂体积称取芒果叶样品1.00g，放入250mL具塞锥形瓶中，以 70/30的甲醇/水混合溶液为提取溶剂，超声时间为30min，按照3.3.1进行芒果苷提取，其中提取溶剂体积分别采用150、180、220、250 mL。 不同的提取溶剂对芒果苷提取率的影响，结果如图3 所示。当提取溶剂为220mL时，芒果苷提取率最高。图3 提取溶剂体积对芒果苷提取率的影响6.9.4 提取次数称取芒果叶样品1.00g，放入250mL具塞锥形瓶中，以体积比 70/30的甲醇/水混合溶液为提取溶剂，超声时间为30min，提取溶剂总体积220mL，按照3.3.1进行芒果苷提取，其中提取次数分别采用1、2、3次。 提取1次的操作方法为：芒果叶样品1.00g(精确至0.01g) ，加入体积比70/30的甲醇/水提取溶剂50mL，高速匀浆1 min，将样品全部转移到250 mL具塞磨口三角瓶中。分别用40mL、30mL提取剂洗涤离心管和刀头共2次，溶液合并至三角瓶中，再加入100 mL, 提取溶剂，将三角瓶瓶塞盖上，放入超声清洗仪中，室温下超声提取30 min。提取2次的操作方法按照3.3.1。提取3次的操作方法为：芒果叶样品1.00g(精确至0.01g) ，加入体积比70/30的甲醇/水提取溶剂50mL，高速匀浆1 min，将样品全部转移到150 mL具塞磨口三角瓶中。分别用40mL、30mL提取剂洗涤离心管和刀头共2次，溶液合并至三角瓶中。将三角瓶瓶塞盖上，放入超声清洗仪中，室温下超声提取30 min。取出，静置20min。将上清转入250 mL容量瓶中，样品残渣留在三角瓶中。三角瓶中加入提取溶剂50mL，超声30 min，进行二次提取，过滤。滤渣中加入提取溶剂50mL，超声30 min，进行三次提取，过滤。合并滤液。不同的提取次数对芒果苷提取率的影响，结果如图3 所示。当提取次数为2次时，芒果苷提取率最高。6.10 芒果苷HPLC定量分析方法的建立6.10.1检测波长选择为了了解芒果苷标样在全波长下主成分与杂质的响应强度，采用HPLC法以PDA检测器对样品进行全波长扫描（200400nm），结果如图5。全扫描结果表明，芒果苷标准样品在258nm 、317nm 、368nm有吸收峰，强度高。a b 图5 芒果苷HPLC 3D扫描图a 芒果苷标准样品，b 溶剂空白芒果苷最大紫外吸收波长为258nm，为了了解芒果苷标样在不同波长下主成分与杂质的响应强度，采用HPLC法分别在258nm 、317nm 、368nm进行检测，结果如图6。三种波长下，258nm时芒果苷响应最强，317nm时次之，368nm时最弱。在中华人民共和国药典（一部）方法（国家药典委员会2015）及相关文献报道中，多采用258nm作为芒果苷检测波长。综合以上信息，选择258nm作为本项目芒果苷HPLC测定的波长。258nm 317nm 368nm 图6 芒果苷不同波长的色谱图6.10.2 色谱柱的选择对照了2款不同的色谱柱，包括Waters Xbridge BEH C18液相色谱柱（250mm*4.6mm, 5 m）以及Agilent ZORBAX SB-Aq液相色谱柱（250mm*4.6mm, 5 m）发现在相同条件下，2种色谱柱均能使主成分与杂质有效分离，与主峰保留时间最接近的杂质的分离度也在2.0以上。但是使用C18柱时主成分响应更高，因此选择采用C18液相色谱柱。 a b 图16 芒果苷在不同的色谱柱分离结果a, Waters Xbridge BEH C18液相色谱柱（250mm*4.6mm, 5 m）; b, 10ppm, Agilent 图7 芒果苷在不同色谱柱分离色谱图 a，Waters Xbridge BEH C18液相色谱柱（250mm*4.6mm, 5 m）；b，Agilent ZORBAX SB-Aq液相色谱柱（250mm*4.6mm, 5 m）6.10.3不同洗脱条件6.10.3.1等度洗脱仪器条件为：Waters 液相色谱仪，UV检测器，Waters Xbridge BEH C18色谱柱（250mm*4.6mm, 5 m）,波长258nm，流量1mL/min，进样体积10 L，柱温25 。等度洗脱方式为流动相A（0.1%甲酸-水溶液）/流动相B（乙腈）=85/15（v/v）。 a 芒果苷ab 溶剂空白图3 等度洗脱模式6.10.3.2梯度洗脱梯度洗脱模式如表1所示，结果如图8。表3 芒果苷梯度洗脱模式时间/min0.1%甲酸-水/%乙腈/%9010290105802078020102080122080149010159010 a 芒果苷 b 溶剂空白图8 梯度洗脱模式6.10.4芒果苷HPLC法检测优化后的色谱条件芒果苷HPLC法检测优化后的色谱条件为：Waters 1525高效液相色谱仪，配置紫外检测器；色谱柱：Waters Xbridge BEH C18色谱柱（250mm*4.6mm, 5 m）；紫外检测波长：258nm；流动相：0.1%甲酸-水溶液/乙腈=85/15（v/v），流量1mL/min；进样体积：10 L；柱温：25 。在该优化色谱条件下，对实际芒果叶样品中芒果苷含量进行测定，典型的液相色谱谱图如图 所示，可以看出芒果苷与杂质分离很好。 a 样品b 溶剂空白图9 实际样品HPLC谱图6.10.5 标准曲线图10 芒果苷标准曲线以峰面积（y）为纵坐标，以含量（x）为横坐标做标准曲线。得标准曲线回归方程标准曲线y = 50600 x 2930，线性关系良好。线性范围：0.01 5.0ug/mL相关系数 r = 0.99936.10.6 检出限和定量限将对照品溶液逐步稀释，进行液相色谱分析，计算其峰高与基线噪音高的比，S/N=3（S为对照品峰高，N为基线噪音高）时的对照品浓度为检出限（LOD），得到芒果苷的检测限0.08 mg/g；S/N=10时的浓度为定量限（LOQ），得到芒果苷的定量限为0.25 mg/g。6.10.7 精密度取配制好的芒果苷对照品溶液，用0.22m微孔滤膜过滤后进行HPLC分析，连续进样6次，芒果苷对照品HPLC分析结果相对标准偏差RSD为0.89%，表明仪器精密度良好，该方法精密度符合要求。结果见表4。表4 芒果苷精密度实验结果样品号芒果苷浓度ug/mL平均值ug/mLRSD%10.9921.0020.8921.01330.99541.00451.01160.9956.10.8 稳定性取同一供试品制备的供试品溶液在0、4、8、12、16、20时，各进样一次，按照上述色谱条件测定，记录芒果苷的峰面积，算得RSD=3.12%，表明供试品溶液在20h内稳定性较好。测定结果见表5。表5 芒果苷稳定性实验结果进样时间h芒果苷浓度mg/g平均值mg/gRSD%022.5922.643.12423.06822.981223.141621.292022.426.10.9 重复性取同一样品，共6 份，分别制备供试品溶液，按照“3.4.4”项下色谱条件进样，测定峰面积，并计算芒果苷浓度。结果，样品中芒果苷的平均浓度为22.64 mg/g，RSD为2.60（n 均为6），表明本方法重复性良好。表6 芒果苷重复性实验结果样品号芒果苷浓度mg/g平均值mg/gRSD%121.7722.242.60222.35323.23421.67522.46621.966.10.10方法的准确度芒果苷加样回收实验结果见表7。实验结果表明，此方法加标回收率良好，芒果苷的平均回收率为91.5%94.8%，RSD范围为2.36%6.59%，说明方法准确度高。表7 芒果苷加标回收结果（n=5）样品添加水平（mg/g）重复测定值（mg/g）平均值（mg/g）回收率(%)平均回收率(%)相对标准偏差RSD(%)溶剂空白-00-基质（本底）-120.6320.73-220.60-320.75-420.63-521.05-加标水平12.50122.88 23.1085.8094.806.59223.23 99.80323.23 99.80423.00 90.80523.18 97.80加标水平25.00125.25 25.3190.4091.502.36225.15 88.40325.38 92.90425.43 93.90525.33 91.90加标水平37.50127.85 27.7994.9394.074.29227.88 95.27327.60 91.60427.40 88.93528.20 99.60346.10.11小结上述结果表明，高效液相色谱法测定芒果叶中芒果苷，实验室内方法检出限为0.08 mg/g，定量限为0.25 mg/g。对芒果叶实际样品进行加标回收实验，回收率在91.50% 94.80%之间，相对标准偏差为2.36% 6.59%，说明方法的精密度和准确度良好。综上所述，本标准方法能够满足芒果叶中芒果苷含量测定要求。6.11 方法验证6.11.1 参加验证的实验室选择5 家具有资质的实验室参加方法的验证工作（表8）。向验证单位提供方法草案、验证方案、标准溶液和验证报告格式。验证单位按照方法草案准备实验用品，在规定时间内完成验证实验并反馈验证结果报告。在方法验证前，参加验证的操作人员应熟悉和掌握方法原理、操作步骤及流程。方法验证过程中所用的试剂和材料、仪器和设备及分析步骤应符合方法相关要求。表8 验证单位与仪器型号序号定值单位HPLC/检测器色谱柱1海南大学分析测试中心Waters e2695 / UV资生堂Tech Mate C18 （250mm*4.6mm, 5 m）2海南省食品检验检测中心Waters e2695 / DADWaters Xbridge BEH C18（250mm*4.6mm, 5 m）3海南省动物疫病预防控制中心Waters e2695 / DADWaters XTerre MS C18（250mm*4.6mm, 5 m）4中国热带农业科学院环境与植物保护研究所Waters e2695 / DADAthena C18 （250mm*4.6mm, 5 m）5中国热带农业科学院分析测试中心Waters 1525 / UVWaters Xbridge BEH C18（250mm*4.6mm, 5 m）6.11.2 方法验证结果5家实验室对芒果苷加标量为2.50、5.00、7.50 mg/g的三个加标水平的芒果叶样品进行了分析测定，结果列于表9表13。海南大学分析测试中心（单位1）验证结果（表9）表明，芒果苷的平均回收率为100.43% 107.84%，RSD范围为2.25% 7.82%。海南省食品检验检测中心（单位2）验证结果（表10）表明，芒果苷的平均回收率为91.17% 104.54%，RSD范围为0.35% 0.74%。海南省动物疫病预防控制中心（单位3）验证结果（表11）表明，芒果苷的平均回收率为99.40% 104.40%，RSD范围为5.40% 7.69%。中国热带农业科学院环境与植物保护研究所（单位4）验证结果（表12）表明，芒果苷的平均回收率为97.00% 100.10%，RSD范围为1.38% 4.75%。中国热带农业科学院分析测试中心（单位5）验证结果（表12）表明，芒果苷的平均回收率为85.10% 98.10%，RSD范围为7.31% 9.74%。表9 方法的回收率 验证单位 1 验证日期 2019-04-23 样品添加水平（mg/g）重复测定值（mg/g）平均值（mg/g）回收率(%)平均回收率(%)相对标准偏差RSD(%)溶剂空白-0.000.00-芒果叶基质（本底）120.0419.99-219.71-320.60-419.54-520.14-620.23-720.33-819.47-919.72-1020.13-芒果叶2.50122.4422.6397.68105.327.82222.73109.04322.4096.11422.79111.64522.92116.68622.59103.46722.4397.37822.92116.70922.4196.381022.70108.16芒果叶5.00124.6025.0291.91100.437.30224.8296.48325.29105.90424.5590.96525.50110.04625.22104.47725.06103.13825.38107.69924.5290.501025.16103.27芒果叶7.50127.8928.09105.20107.842.25227.96106.14328.26110.19427.96106.13528.36111.49628.34111.13727.94105.93828.08107.72928.17108.991027.91105.44表10 方法的回收率 验证单位 2 验证日期 2019-05-13 样品添加水平（mg/g）重复测定值（mg/g）平均值（mg/g）回收率(%)平均回收率(%)相对标准偏差RSD(%)溶剂空白-0.000.00-芒果叶基质（本底）120.7520.72-220.72-320.32-420.75-520.40-620.68-720.68-820.82-920.80-1021.22-芒果叶2.50122.9523.0089.4091.200.71222.9890.40322.9288.40422.8284.40522.9890.40623.1898.40723.30103.40823.1597.40922.7882.401022.9087.40芒果叶5.00125.9525.94104.69104.540.74225.75100.69325.80101.69426.20109.69525.6899.19625.92104.19725.80101.69826.02106.19926.05106.691026.25110.69芒果叶7.50128.1828.0099.4797.170.35227.8595.13328.0097.13427.9896.80528.0297.47628.0097.13728.0898.13827.9095.80928.1098.471027.9296.13表11 方法的回收率 验证单位 3 验证日期 2019-04-17 样品添加水平（mg/g）重复测定值（mg/g）平均值（mg/g）回收率(%)平均回收率(%)相对标准偏差RSD(%)溶剂空白-0.000.00-芒果叶基质（本底）121.2521.165-221.10-321.10-421.28-521.10-芒果叶2.50123.5823.6596.40 99.40 7.69 223.80105.40 323.90109.40 423.5394.40 523.4591.40 芒果叶5.00126.5526.385107.70 104.40 7.08226.38104.20 325.7591.70 426.63109.20 526.63109.20 芒果叶7.50129.0028.88104.47 102.87 5.40229.30108.47 329.20107.13 428.3395.47 528.5898.80 表12 方法的回收率 验证单位 4 验证日期 2019-04-28 样品添加水平（mg/g）重复测定值（mg/g）平均值（mg/g）回收率(%)平均回收率(%)相对标准偏差RSD(%)溶剂空白-0.000.00-芒果叶基质（本底）121.3821.44-221.65-321.65-421.28-521.28-621.40-721.55-821.45-921.72-1021.62-芒果叶2.50123.9223.8399.20 97.004.75223.8094.20 323.95100.20 423.6889.20 523.8094.20 623.7592.20 724.02103.20 823.8897.20 923.9299.20 1023.98101.20 芒果叶5.00126.5526.49102.10 100.10 2.34 226.45100.10 326.3898.60 426.58102.60 526.50101.10 626.3297.60 726.4299.60 826.48100.60 926.60103.10 1026.2295.60 芒果叶7.50128.6228.8495.73 98.97 1.38 228.8899.07 328.8598.73 428.8298.40 529.00100.73 628.9099.40 728.9099.40 828.9099.40 928.98100.40 1028.8298.40 表13 方法的回收率 验证单位 5 验证日期 2019-04-28 样品添加水平（mg/g）重复测定值（mg/g）平均值（mg/g）回收率(%)平均回收率(%)相对标准偏差RSD(%)溶剂空白-0.000.00-芒果叶基质（本底）120.4820.80-220.63-320.60-420.98-521.13-620.63-720.75-820.63-921.18-1021.05-芒果叶2.50122.8823.2583.0098.109.74 223.2397.0032