实验三对流免疫电泳.ppt

实验三对流免疫电泳 实验目的 掌握对流免疫电泳的原理 操作方法 结果判定及了解其用途 实验原理 带电胶体颗粒可在电场中定向移动 移动速度及方向与颗粒所带电荷及分子量大小有关 蛋白质为两性电解质 每种蛋白质都有自己的等电点 在pH值大于其等电点的溶液中 羧基解离多 蛋白质带负电 向正极泳动 在pH值小于其等电点的溶液中 氨基解离多 蛋白质带正电 向负极泳动 pH值离等电点越远 所带电荷越多 泳动速度也越快 因此 可通过控制溶液的pH值的方法 使抗原抗体在通电的琼脂板上泳动 进行抗原抗体成分的分析 或进行抗原抗体的检测 电泳缓冲液pH为8 6 在这种溶液中 抗原分子羧基解离带负电荷 且分子量小 泳动速度快 能克服琼脂中的电渗阻力 故在电泳时从负极向正极移动 抗体属球蛋白 所暴露的极性基团较少 在碱性缓冲液电离也少 只带微弱的负电荷 且相对分子质量较大 电泳力较小 泳动速度慢 克服不了电渗阻力 在琼脂电渗力作用下反而由正极向负极移动 将抗体置正极端 抗原置负极端 则电泳时抗原抗体相向泳动 在两孔之间相遇 在比例最合适处就会形成白色沉淀线 免疫电泳的特点 免疫电泳是由琼脂扩散与电泳结合而成的一种检测技术 抗原抗体在凝胶中扩散的同时 加入电场力的作用 使抗体或抗原在凝胶中的扩散移动速度加快 缩短了试验时间 同时限制了扩散移动的方向 使集中朝电泳的方向扩散移动 增加了试验的敏感性 所以该方法比一般的凝胶扩散试验更快速和灵敏 实验材料 1 电泳缓冲液0 05M LpH8 6巴比妥缓冲液 2 抗体羊抗人的IgG血清 3 抗原人的IgG 4 1 琼脂用pH8 6巴比妥缓冲液配置 冰箱保存备用 5 仪器电泳仪 电泳槽6 器械载玻片 打孔器 10ml吸管 移液器 移液头 实验方法 1 1 0 琼脂板制备 取pH8 6巴比妥缓冲液100ml置于搪瓷缸中 加入1g琼脂粉 加热至完全溶解 冰箱保存备用 加热熔化1 0 琼脂 待冷却至50 60 时 用10mL吸管吸取6mL加于载玻片上 2 打孔在凝固后的琼脂板上 用打孔器打两排孔 孔间距为4mm 3 加样将抗原加入琼脂板上有标记孔侧的小孔中 抗体加入另一侧小孔中 以加满为度 不可溢出孔外 4 电泳将加好样品的琼脂板置电泳槽上 抗原侧置负极端 抗体孔侧置正极端 搭好桥后 接通电源 控制电压6 10V cm板长 电泳约30 60min 5 关闭电源 取出琼脂板 观察结果 实验结果 将玻片对着光源 观察抗原孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出现 如有沉淀线 则表示阳性 否则为阴性 注意事项 电泳时电流不宜过大 以免蛋白变性 抗原和抗体的电极方向不能搞错 抗原和抗体的浓度要适当 抗原太浓或太稀都不易出现沉淀线 电泳所需时间与孔间距离有关 距离越大 电泳时间越长 琼脂的质量要好 选用进口或者进口分装 否则不易出现结果 也可选用琼脂糖 琼脂的浓度不宜太高 1 2 应以容易挑出孔内琼脂为宜 思考题 1 对流免疫电泳有何特点 2 对流免疫电泳中 抗原为何放阴极端 抗体为何放阳极端