实验一质粒DNA的提取.ppt

实验一质粒DNA的提取 实验目的实验原理实验仪器 材料与试剂实验步骤实验结果及讨论 实验目的 了解碱法提取质粒的原理 掌握碱法提取质粒的方法 掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法 实验原理 质粒是一种细菌染色体外的 具有自主复制能力的 共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子 碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们 结构的三大要素 多克隆位点选择标记 耐药性 LacZ 独立的复制单位种类 质粒噬菌体酵母人工染色体 YAC 反转录病毒载体表达载体等 pET 32aVector ThepETSystemisthemostpowerfulsystemyetdevelopedforthecloningandexpressionofrecombinantproteinsinE coli pET 32cloning expressionregion Vector pET 32a Genefragment SmPR10 pET 32a SmPR10 质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的 当菌体在NaOH和SDS溶液 碱性条件pH12 5 中裂解时 蛋白质与DNA发生变性 由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同 染色体DNA双螺旋结构解开 而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂 但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起 当加入乙酸钾溶液pH恢复至中性时 在高盐浓度的情况下 染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质 SDS复合物等形成沉淀 不同的是 质粒DNA复性迅速而准确 保持可溶状态而留在上清中 这样 通过离心可沉淀大部分细胞碎片 染色体DNA RNA及蛋白质 除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤 可得到较纯的质粒DNA 实验仪器 材料与试剂 一 仪器1 恒温摇床2 超净工作台3 高压灭菌锅4 高速台式离心机5 微量取液器 二 材料 大肠杆菌E coliDH5 含重组质粒pET 32a SmPR10 三 试剂 1 LB液体培养基 1L 胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g加去离子水至800ml 搅拌 使溶质完全溶解 用NaOH调节pH值至7 0 加入去离子水至总体积为1升 高压蒸汽灭菌20分钟 LB固体培养基 1L 在上述LB液体培养基 1L 中加入琼脂粉15g 2 溶液 葡萄糖 50mmol L Tris HCl 25mmol L pH8 0 EDTA 10mmol L 3 溶液 NaOH 0 2mol L SDS 1 新鲜配制 4 溶液 60ml的5mol LKAC 11 5ml的冰醋酸 28 5mlH2O 溶液I 低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度 减少抽提过程中的机械剪切作用 防止破坏DNA EDTA的作用是螯和掉Mg2 Ca2 等二价金属离子 防止DNA酶对质粒分子的降解作用 Tris Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围 溶液II SDS的作用 破坏细胞膜 解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性 NaOH pH 12 的作用 破坏氢键 使DNA分子变性 溶液III 由KAc与HAc组成 是pH值为5 5的高盐溶液 能中和溶液II的碱性 使DNA复性 但是质粒DNA与染色体DNA复性的速度不同 K 离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去 溶液中的染色体DNA也会与蛋白质 SDS形成相互缠绕的大分子物质 很容易与小分子的质粒DNA分离 5 氨苄青霉素 Amp 用无菌水配制成100mg ml溶液 置 20 冰箱保存备用 6 RNaseA将RNA酶A溶于10mmol LTris Cl pH7 5 15mmol LNaCl中 配成10mg ml的浓度 于100 加热15分钟 缓慢冷却至室温 分装成小份保存于 20 7 酚 氯仿 1 1 氯仿 异戊醇 24 1 乙醇 75 乙醇 实验步骤 质粒的提取1 用灭菌的牙签挑取单菌落放入1 2mlLB液体培养基 含Amp0 1mg ml 中 37 振荡培养过夜 2 将菌液倒入1 5mlEppendorf管中 10 000rpm离心1min 弃上清液 3 加入100 lSolutionI 涡旋使细胞充分悬浮 4 加入200 lSolutionII 立即上下颠倒离心管5 10次 使之混匀 注意动作轻 冰上放置5min 5 加入150 lSolutionIII 立即上下颠倒离心管5 10次 使之混匀 注意动作轻 冰上放置5min 6 15 000rpm 离心10min 将上清移至一干净的1 5mlEppendorf管中 注意所取体积 约400 l 7 加入等体积酚 氯仿 1 1 颠倒数次混匀 注意动作轻 12 000rpm 4 离心3min 取上清液 8 小心吸取上清液中至一干净的1 5mlEppendorf管中 加入等体积的氯仿 异戊醇 24 1 颠倒数次混匀 12 000rpm 4 离心3min 取上清液 9 小心吸取上清液中至一干净的1 5mlEppendorf管中 加入2倍体积的无水乙醇 颠倒混匀 于冰上放置10min 4 离心 15 000rpm 10min 10 弃上清 加1ml75 乙醇漂洗沉淀 4 离心 10 000rpm 5min 11 去掉上清 注意沉淀勿丢失 室温或真空干燥沉淀 12 加入50 lTEbuffer 室温振荡溶解质粒DNA 培养细菌使质粒扩增 1 挑取琼脂培养板上的单菌落至2mlLB培养液中 含Amp100 g ml 37 摇荡培养过夜 2 取1ml菌液转接到一个含有100mlLB培养液三角瓶中 含Amp100 g ml 37 摇荡培养过夜 37 振摇过夜 37 振摇过夜 Tiangen质粒DNA小量提取试剂盒 实际用 操作过程1 柱平衡 向吸附柱CP3中 吸附柱放入收集管中 加入500 l的平衡液BL 12 000rpm离心1min 倒掉收集管中的废液 将吸附柱重新放回收集管中 2 将1 2ml过夜培养的细菌菌液加入1 5ml离心管中 12 000rpm离心1分钟 并弃去上清液 如有需要 可多次重复步骤2 以收集更多细菌菌体 但勿过量 以免影响提取质粒的质量 3 加200 l溶液P1 用前检查是否已加入RNaseA 重悬细菌体沉淀 使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀 4 加200 l溶液P2 温和地上下翻转6 8次使菌体充分裂解 注意不要剧烈振动 以防止基因组DNA被打断 注意不要让反应持续超过5分钟 5 加300 l溶液P3 立即轻柔颠倒离心管6 8次 充分混匀 此时溶液应该出现白色絮状沉淀 6 12 000rpm离心10分钟 如离心机转速不够可延长离心时间 直至形成紧密的白色沉淀 7 将步骤6离心后得到的上清液转移到吸附柱CP3中 12 000rpm离心30 60秒 并弃去接液管内液体 8 向吸附柱CP3内加600 l漂洗液PW 12 000rpm离心30 60秒 并弃去收集管内废液 9 重复第8步一次 10 将吸附柱CP3放入收集管中 12 000rpm离心2分钟 目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除 漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应 酶切 PCR等 实验 为确保下游实验不受残留乙醇的影响 建议将吸附柱CP3开盖 置于室温放置数分钟 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液 11 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中 向吸附膜的中间部位滴加40 l洗脱缓冲液EB 室温放置2分钟 12 000rpm离心2分钟 将质粒溶液收集到离心管中 12 提取的质粒DNA可直接用于各类下游分子生物学实验 如果不立即使用 请保存于 20 实验结果及讨论 碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一 提取量较大 便于操作 如有蛋白质残留 干燥后不透明 而呈白色 在质粒提取中 质粒DNA与染色体DNA分离的主要依据是什么