实验六PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测.ppt

实验六PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测 常祖明 实验目的 1 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理2 学会琼脂糖凝胶的制作和进行电泳的方法 实验原理 1 DNA琼脂糖凝胶电泳的原理 琼脂糖是一种线性多糖聚合物 天然聚合长链状分子 在沸水中溶解 45 开始形成多孔性刚性滤孔 凝胶孔径的大小取决于琼脂糖的浓度 浓度越高 孔隙越小 其分辨能力就越强 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 实验原理 1 电荷效应DNA分子在PH值高于其等电点的溶液中带负电荷 在电泳时向阳极移动 2 分子筛效益在一定的电场强度下 DNA分子的迁移速度主要取决于分子筛效益 即DNA分子本身的大小和构象 共价闭环DNA 线状DNA 开环DNA 而且其迁移速度与其相对分子质量的对数值成反比 所以不用相对分子质量的DNA分子可以在琼脂糖凝胶电泳中分离 2 DNA分子进行染色的原理 以溴化乙锭为例 观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂 用于观察琼脂糖凝胶中的DNA分子 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光 当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时 溴化乙锭从正极向负极移动 这样溴化乙锭分子就会嵌入到DNA分子中的碱基对之间形成络合物 这种络合物在紫外光下发射的荧光要比单纯的DNA分子要强的多 便于DNA的检测 实验仪器 材料 试剂 实验仪器及用具电泳仪 移液枪 电磁炉 锥形瓶 容量瓶 紫外分析仪实验材料及试剂实验材料 鸡血DNAPCR扩增产物DNAMarker GoldView核酸染色剂 琼脂糖 三羟甲基氨基甲烷 Tris 硼酸 乙二胺四乙酸二钠 6 DNALodingBuffer实验试剂 0 5 TBE PH8 0 缓冲液 1 0 琼脂糖溶液 实验步骤 琼脂糖凝胶的配制 1g琼脂糖 100mlTBE缓冲液 5 lGoldView 冷却到60 1 将适量的DNAMarker用移液枪加入凝胶的第一个孔中 2 在PCR产物中加入6 DNALodingBuffer 每5ul产物加入1ul 混匀后 用移液枪加入到样品孔内 每孔加2ul 点样 肉眼可见指示剂泳至距制胶板前端约2 3cm处即可停止电泳 切断电源 取出凝胶 置于紫外线透射仪上观察电泳结果 或用凝胶成像分析系统拍照保存 电泳 观察 注意事项 1 琼脂糖融化时 档位不宜太高 2 制胶和加样过程中要防治气泡的产生 3 操作过程必须戴手套操作 严格注意防护 4 加样时 Tip头不宜插入样品孔太深 也不要穿破胶孔壁 否则样品渗漏或DNA带型不整齐 5 电源接通时 应核实凝胶的方向是否正确 6 电泳仪有电压显示 并不一定标志电泳槽已接通 应观察电极气泡出现情况 负极的气泡比正极多一倍 表示电泳已开始 将两者混匀后加入点样孔 注意枪头尽量往下 同时防止气泡产生 讨论 影响DNA迁移速率的因素有哪些