实验1大肠杆菌的培养和分离.ppt

实验1 大肠杆菌的培养和分离 微生物包括哪五类 病毒细菌放线菌真菌原生生物 特点 结构简单 形体微小 通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到 有的甚至没有细胞结构 且体内一般不含有叶绿素 不能进行光合作用 原核生物界 原生生物界 真菌界 病毒界 一 基础知识 一 微生物 大肠杆菌 E coli 分布 人和哺乳动物肠道 此外还广泛分布于水 污水 土壤 谷类 乳制品等当中 大肠杆菌在人体的 中一般对人体无害 但任何大肠杆菌如果进入 都会对人体产生危害 大肠杆菌是 工程中被广泛采用的工具 肠道 泌尿系统 基因 革兰氏 填阴或阳 性菌 阴 代谢类型 异养 兼性厌氧型 生长适宜温度 质粒 EcoR 限制酶 E coli DNA连接酶 受体细胞 37 左右 细菌的代谢类型 自养型细菌异养型细菌 光合自养型 化能自养型 大部分腐生菌和寄生菌 如蓝细菌 如硝化细菌 1 同化作用类型 2 异化作用类型 需氧型细菌厌氧型细菌兼性厌氧型细菌 大多数细菌 如破伤风杆菌 如酵母菌 大肠杆菌 大肠杆菌属于异养 兼性厌氧型细菌 大肠杆菌 酵母菌 放线菌 霉菌 菌落 单个或少数细菌在固体培养基上大量生长繁殖时 所形成的肉眼可见的具有一定形态结构的子细胞群体 不同微生物形成的菌落具有不同的特征 是鉴定菌种的重要依据 如菌落的大小 形状 边缘 光泽度 颜色 透明度等 菌落的概念 白色或乳白色 光滑 大肠杆菌菌落 芽孢 有些细菌在一定的条件下 细胞里面形成一个椭圆形的休眠体 叫做芽孢 芽孢的壁很厚 对干旱 低温 高温等恶劣的环境有很强的抵抗力 例如 有的细菌的芽孢 煮沸3小时以后才死亡 芽孢又小又轻 可以随风飘散 当环境适宜 如温度 水分适宜 的时候 芽孢又可以萌发 形成一个细菌 一 基础知识 二 培养基 培养基 培养液 是由人工方法配制而成的 专供微生物生长繁殖使用的混合营养液 1 按物理状态分 固体培养基和液体培养基 半固体培养基 2 按功能分 选择培养基和鉴别培养基 3 按成分分 天然培养基和合成培养基 1 培养基的类型和用途 液体培养基 表面生长 均匀混浊生长 沉淀生长 固体培养基 菌落 菌苔 半固体培养基 无动力有动力 弥散 是否运动 选择培养基 加入青霉素的培养基 分离酵母菌 霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基 分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基 分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基 分离杂交瘤细胞 天然培养基有血清 血浆 和组织提取液 如鸡胚和牛胚浸液 优点 营养成分丰富 培养效果好缺点 来源受限 成分复杂 影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析 易发生支原体污染 根据细胞生存所需物质的种类和数量 用人工方法模拟合成的 合成培养基主要成分是氨基酸 维生素 碳水化合物 无机盐和其它一些辅助物质 优点 标准化生产 组分和含量相对固定 成本低缺点 缺少某些成分 不能完全满足体外细胞生长需要 合成培养基 天然培养基 血清中含有 多种蛋白质 白蛋白 球蛋白 铁蛋白等 多种金属离子 激素 促贴附物质 如纤粘蛋白 冷析球蛋白 胶原等 各种生长因子 转移蛋白 不明成分 人工合成培养基只能维持细胞生存 要想使细胞生长和繁殖 还需补充一定量的天然培养基 如血清 培养基的用途 液体培养基 增菌 常用于发酵工业固体培养基 增菌 菌种保存及分离纯化 鉴定菌落 活菌计数等半固体培养基 动力检测 保种 不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 调节pH 2 成分 水 碳源 氮源 无机盐 生长因子 生长因子即细菌生长必需 而自身不能合成的化合物 如维生素 某些氨基酸 嘌呤 嘧啶 真菌 5 6细菌 6 5 7 5 有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压 1 无菌操作的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中 所有防止 污染的方法 四 无菌操作 必须无菌 也必须要无菌 时不能带入其他杂菌 主要包括 杂菌 2 消毒与灭菌的概念及两者的区别 消毒 使用较温和理化因素 仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的微生物的过程 不能杀死芽孢和孢子 灭菌 使用强烈的理化因素消灭物体内外所有微生物 包括芽孢和孢子 各种器具 培养基 转移菌种 比较消毒与灭菌 较为温和 部分生活状态的微生物 不能 能 全部微生物 强烈 高压蒸汽灭菌 湿热灭菌 洒精灯灼烧灭菌干热灭菌 1 灭菌方法 3 常用的灭菌和消毒的方法 培养基 无菌水 各种耐高温的玻璃金属器具100kPa 121 下维持15 30min 需要保持干燥耐高温的玻璃金属器皿160 170 下加热1 2h 接种环等金属器具 1 煮沸消毒法 100 煮沸5 6min2 巴氏消毒法 70 75 下煮30min或80 下煮15min3 化学药剂消毒法 用75 酒精 新洁尔灭等进行皮肤消毒 氯气消毒水源4 紫外线消毒 2 消毒的方法 3 常用的消毒与灭菌的方法 请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌 如果需要 请选择合适的方法 1 培养细菌用的培养基与培养皿 2 玻棒 试管 烧瓶和吸管 3 实验操作者的双手 答 1 2 需要灭菌 3 需要消毒 一 制备LB培养基 通用的细菌培养基 1 配方 蛋白胨0 5克 酵母提取物0 25克 氯化钠0 5克 水50ml 配固体培养基再加琼脂1克 溶解 计算称量 调pH 分装 加塞 包扎 2 流程 二操作步骤 灭菌 倒平板 分装 注意不要使培养基沾在管口或瓶口上 因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用 加塞 试管用塑料盖或 三角瓶口用 或 封口 再用 或报纸封口 包扎 用 或报纸 三角漏斗 棉花塞 封口膜 6层纱布 牛皮纸 牛皮纸 高压蒸气灭菌法 灭菌 1 加水 2 装锅 向外层锅内加入适量的水 加水的要求是 物品放置的要求 加盖 将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的 内 再以 方式同时旋紧相对的两个螺栓 使螺栓松紧一致 勿使漏气 不触及内胆 整齐 稳定 留出空隙 排气槽 两两对称 3 加热排气 4 保温保压 5 出锅 打开排气阀 使水沸腾以排除锅内的 后 关上排气阀 当锅内压力升到 kg cm2时 控制热源 维持压力至 min 切断电源 让灭菌锅内温度自然下降 当压力降至 时 打开 旋松螺栓 打开盖子 取出灭菌物品 冷空气 待冷空气完全排尽 0 1 15 排气阀 否则会因锅内压力较高 打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染 甚至使容器爆炸 灭菌后 通常将实验用具放入60 80 中烘干 以除去灭菌时的水分 避免引起 烘箱 污染 倒平板 待培养基冷却至 时 将每只培养皿倒入 ml未凝固的固体培养基 置于 位置上 轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部 待凝 使之形成平面 备用 制斜面 将未凝固的固体培养基的试管 放 冷却待凝使即成为斜面 10 12 水平 倒置 斜 倒平板 制斜面操作平台 灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开 和 灭菌30min 过滤风 紫外线 超净台 思考题 A 操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些 1 灭菌后的培养基 器具置于超净台上 并打开超净台的紫外灯和过滤风 灭菌30分钟 2 用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手 3 整个操作在酒精灯火焰旁进行4 打开后或加塞前试管口 三角瓶口灼烧灭菌 B 培养基灭菌后 需要冷却到60后才倒平板 你用什么办法来估计培养基的温度呢 可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时 就可以进行倒平板了 思考题 C 为何要将平板倒置 平板冷凝后 皿盖上会凝结水珠 凝固后的培养基表面的湿度也比较高 将平板倒置 既可以使培养基面的水分更好地挥发 又可以防止皿盖上的水珠落培养基 造成污染 D 在倒平板的过程中 如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位 这个平板还能用来培养微生物吗 为什么 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生 因此最好不要用这个平板培养微生物 E 如何检查培养基是否受杂菌的污染 将未接种的培养基放在恒温箱中培养 若无菌落产生则未受杂菌污染 二 液体培养基接种培养 主要器具 操作方法 先将接种环进行 灭菌 后的接种环挑取少量菌种 放入三角瓶的液体培养基中 加塞 置于 摇床振荡培养 小时 无菌操作 略 摇床 思考 如何冷却接种环 可通过接触试管内壁或未长菌的培养基达到冷却的目的 接种环 摇床等 灼烧 冷却 三 平板划线分离法 主要器具 操作过程 注意 无菌操作方法 同前 将培养皿 盖在下 放于 恒温培养箱中培养 小时 在作第二次以及其后的划线操作时 要从上一次划线的开始 划线 接种环 思考 若如上图所示进行划线分离 则接种环总共进行几次灼烧灭菌 恒温培养箱 每次划线前接种环都要灼烧灭菌 再冷却 末端 倒置 平板划线的操作方法交叉划线法连续划线法 1 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后 接种环上残留的菌种 使下一次划线时 接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端 从而通过划线次数的增加 使每次划线时菌种的数目逐渐减少 以便得到单个菌落 2 在划线操作结束时 仍然需要灼烧接种环吗 为什么 划线结束后灼烧接种环 及时杀死接种环上残留的菌种 避免细菌污染环境和感染操作者 3 在灼烧接种环之后 为什么要等其冷却后再进行划线 以免接种环温度太高 杀死菌种 4 在作第二次以及其后的划线操作时 为什么总是从上一次划线的末端开始划线 划线后 线条末端细菌的数目比线条起始处要少 每次从上一次划线的末端开始 能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落 5 如何判断接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色 形状 大小基本一致 并符合大肠杆菌菌落的特点 则说明接种操作是符合要求的 如果培养基上出现了其他菌落 则说明接种过程中 无菌操作还未达到要求 四 稀释涂布平板法 主要器具 玻璃三角刮刀 移液管或吸管 操作过程 先将培养菌液稀释 10 5 10 7倍 用移液管或吸管取0 1ml稀释度不同的菌液 加在平板上 用无菌玻璃三角刮刀均匀涂布在培养基平面上 在适当稀释度下 可培养得到相互分开的的菌落 将培养皿倒置 盖在下 放于 恒温培养箱中培养 小时 划线分离方法简单 涂布分离 易形成单菌落 但操作复杂些 10g土样 从土壤中分离微生物 稀释涂布法 五 斜面接种及菌种保存 主要器具 操作过程 在无菌操作下 用接种环挑取 菌落 再用划线法 自斜面底部向上轻轻划直线 接种在 上 恒温培养箱中培养 小时后 冰箱保存 无菌操作 同前 试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多 不容易进入杂菌 同时能用来做纯细菌的长期保存 思考 菌种保存为何采用斜面而不是平板 接种环 恒温箱 冰箱 单 斜面 菌种的保存 1 临时保藏 接种到固体斜面培养基 菌落长成后置于4 冰箱保存 2 长期保存 甘油冷冻管藏法 思考题 利用培养基技术不仅可以分离微生物 也可以进行植物组织培养 请简要说明这两项技术应用设计思路的相同点以及区别 相同点 都是从培养对象所需的营养条件出发 配置适宜培养基 都要求严格的无菌条件 不同点 植物组织培养往往还要加入激素 例1 关微生物营养物质的叙述中 正确的A 是碳源的物质不可能同时是氮源B 凡碳源都提供能量C 除水以外的无机物只提供无机盐D 无机氮源也能提供能量 D 例2 右表是某微生物培养基成分 请据此回答 1 右表培养基可培养的微生物类型是 2 若不慎将过量NaCl加入培养基中 如不想浪费此培养基 可再加入 自养型微生物 含碳有机物 超净工作台 紫外灯过滤风 实验一大肠杆菌的培养和分离 实验步骤 一配制LB培养基 溶解 计算称量 调pH 分装 加塞 包扎 灭菌 二 倒平板 制斜面 三大肠杆菌的培养 三大肠杆菌的分离 平板划线分离法 或稀释涂布平板法 使所需细菌大量繁殖 获得单菌落 纯化菌株 四斜面接种培养 目的菌株的纯培养和菌种保存