间接红细胞凝集试验诊断血吸虫病.ppt

间接红细胞凝集试验诊断血吸虫病 间接红细胞凝集试验 Indirecthaemagglutinationtest IHA 以红细胞为载体吸附预先制备的特异性抗原或抗体作为试剂检测标本中的相应抗体或抗原血清学方法特点 抗原与其抗体之间的特异性反应红细胞凝集现象 国外最早于1955年应用于检测马抗血清国内陶义训等 1958 首先应用于诊断日本血吸虫病杨赞元等 1976 应用冰冻干燥方法制备试剂 一 基本概念 一 凝集反应是指细菌 细胞等颗粒性抗原加入相应抗体 并在适量电解质存在的条件下 两者特异性结合且进一步凝聚成肉眼可见的小块 凝集反应分为直接凝集和间接凝集反应 二 间接红细胞凝集试验 原理日本血吸虫可溶性虫卵抗原载体颗粒绵羊 家兔 鸡的红细胞及O型人红细胞致敏的新鲜红细胞保存时间短 且易变脆 溶血和污染 只能使用2 3天致敏前将红细胞醛化 可长期保存而不溶血常用的醛类有甲醛 戊二醛 丙酮醛 三 间接血凝的类型 IHA 用抗原致敏红细胞检测标本中抗体反向间接血凝试验 用特异性抗体致敏红细胞检测标本中的相应抗原间接血凝抑制试验反向间接血凝抑制试验 正向 间接凝集反应 反向间接凝集反应 间接凝集抑制反应 一 血吸虫虫卵抗原制备分离虫卵 脱水 脱酯干燥 研磨成细粉 冻融 超声粉碎 普通离心 高速离心 经离心后的上清液 即为虫卵抗原原液 保存于 20 中备用 二 冻干致敏红细胞的制备 理想抗原敏感性高 特异性强 能区别不同感染度 能区别现在感染还是过去感染 价廉 但目前还没有 今后可能依靠杂交瘤技术 DNA技术而获得理想的抗原 取人 O 型血红细胞3份 不同个体 混合 用生理盐水洗涤 置冰浴内 将戊二醛溶液慢慢滴入红细胞悬液中 边加边摇 醛化1h 用1 10000的柳硫汞蒸馏水配成10 的红细胞悬液 置于4 备用 二 红细胞醛化 醛化红细胞优点克服了个体差异 保证实验重复性延长红细胞的保存时间 在4 可保存1年避免操作过程中因振荡 低渗 冻融使红细胞破裂 溶血 取1 10000鞣酸溶液与等量2 5 红细胞悬液混匀 置于37 中15min 并不断摇动 洗涤 去除多余的鞣酸 三 红细胞鞣化 鞣化红细胞的优点鞣化后红细胞易吸附蛋白抗原 取虫卵抗原原液1 100稀释 与2 5 的鞣化红细胞等量混合 置于37 水浴中30min 并不断摇动 然后离心 洗涤 去除多余抗原 用含有5 蔗糖及1 正常兔血清 56 灭活 的pH7 2PBS保护液 配成10 浓度的致敏红细胞悬液 致敏效果与抗原的活性及纯度有关 四 红细胞致敏 将上述致敏红细胞悬液摇匀 分装于2ml安瓿内 每支0 4ml 立即放入 40 冰箱冰冻 待全部分装完毕后 移入冰冻干燥机内 冰冻干燥约24h 干燥后封口 保存于4 中备用 冰冻干燥具有高科技含量不是单纯干燥 在冰冻状态下使水分子升华 不使红细胞破裂 不影响抗原活性 五 致敏红细胞的冰冻干燥 三 操作步骤 一 取生理盐水2ml 加入装有冰冻干燥红细胞的安瓿中 配成2 0 的红细胞悬液 摇匀 二 在 V 型微量血凝反应板的第1孔中加生理盐水100 l 第2 3孔中各加25 l 三 第1孔中加待检血清25 l 混匀后吸出25 l加于第2孔中 在第2孔中混匀后 吸出25 l加于第3孔中 混匀后弃去25 l 此时第1 2 3孔中的血清稀释度依次为1 5 1 10 1 20 四 在第2 第3孔中各加致敏红细胞悬液25 l 将反应板放在振荡器上振荡1min 室温下静置45min 观察反应结果 四 反应标准 一 阴性反应 红细胞全部下沉在凹底部 形成紧密的圆点 周围整齐清晰 二 阳性反应 待检者血清以1 10稀释度出现凝集反应为阳性起点 三 反应强度 红细胞全部下沉在凹底部 形成紧密的圆点 周围整齐清晰 多数红细胞下沉在凹底部形成圆点 周围可见少量凝集红细胞 凹底部可见明显的红点 凝集红细胞在底部形成小薄层 凹底部可见很弱的红点 红细胞呈疏松的颗粒凝集 红细胞呈明显的颗粒凝集 均匀散布于凹底部周围形成薄层 有时呈皱褶状效价 滴度 发生凝集现象最高的血清稀释度 五 影响因素及注意事 一 试剂 保存 对照 效价 摇匀 二 反应板 V 型 底角应为90 反复冲洗 三 毛细吸管 校正 垂直 四 血清样本 新鲜为宜 保存在冰盒内 溶血样本将影响测定结果的准确性 五 生理盐水 用于稀释IHA试剂 阳参 阴参 血清样本的生理盐水必须保持无菌 六 判断反应结果 在判断反应结果时应在反应板下面衬一张白纸 使反应结果更加清晰 先观察空白对照 阴参 阳参 再观察样本 六 评价 IHA的优点 敏感性高 阳性符合率在90 以上 对粪检阳性者可高达95 假阳性率一般不超过4 操作方便 用血量少 便于现场使用 试剂生产方便 成本低 符合国情 IHA的缺点 特异性欠强 与其它吸虫有较高的交叉反应 交叉反应主要在肺吸虫感染 可达50 以上 七 实用价值 一 可作为血吸虫病的辅助诊断 无血治史者和治疗史3年以上者 IHA阳性可给予扩大治疗 二 在血吸虫病流行区 可作为查病的过筛方法 三 可作为血清流行病学调查及疫情监测的方法 谢谢大家