高效液相色谱分析方法开发.ppt

分析方法开发三步骤 HPLC分析方法开发 选择合适的色谱柱 固定相 和流动相 得到合理的保留时间 调整选择性以及各个色谱峰的分离度 调整流速 填料粒径 色谱柱规格 长度及内径 以获得最佳的分离 开发分析方法的规则 合适的保留因子k k值1 20 是获得满意分离的基础保留因子k tR tM tM 用以下 秘诀 可以使您的开发过程更加简便 快速 揭秘 选择合适的起始条件 不同的样品不同的思路中性化合物无需调整流动相的pH值 而对于含有带电基团的化合物 则需要用缓冲溶液调整流动相的pH值 有时需要采用离子对反相色谱 选用通用的色谱柱一般直接选用C18 或C8 5um12 5 15 25cm长的色谱柱 选择流动相甲醇 水或乙腈 水 依据个人习惯而定 流动相的调整 秘诀 秘诀1由强到弱一般先用90 的乙腈 或甲醇 水 或缓冲溶液 进行试验 这样可以很快地得到分离结果 然后根据出峰情况调整有机溶剂 乙腈或甲醇 的比例 流动相的调整 秘诀 秘诀2三倍规则每减少10 的有机溶剂 甲醇或乙腈 的量 保留因子约增加3倍 此为三倍规则 这是一个聪明而又省力的办法 调整的过程中 注意观察各个峰的分离情况 秘诀3粗调转微调当分离达到一定程度 应将有机溶剂10 的改变量调整为5 并据此规则逐渐降低调整率 直至各组分的分离情况不再改变 流动相的调整 秘诀 流动相的调整 秘诀 秘诀4更换流动相的组成在第三步 我们已经基本上得到了一个合适的保留因子 如果还有一些组分的分离情况不好 则应考虑更换流动相的组成 如有机溶剂类型的改变 pH值的改变或是加入离子对试剂 等等 或者 索性改变固定相的类型 色谱柱的调整 根据操作压力 出峰时间 分离度来调节色谱柱的长度 粒径以及流动相流速 从而获得最佳的分离 最后