《食用菌菌种的制备》PPT课件.ppt

第四章食用菌菌种的制备 第一节菌种生产流程及设备一 菌种生产流程 一 菌种类型根据菌种来源和生产目的 通常将菌种分为母种 原种 栽培种三级 1 母种 是指首次从大自然分离得到的纯菌丝体 它是生产其它菌种类型的原始种 俗称一级种 因其在试管里培养而成 也称试管种 扩大繁殖后 叫再生母种 2 原种 来自一级种的扩大培养 是母种和栽培种之间的过渡种 也称二级种 3 栽培种 是由原种扩接而繁殖得出的种 直接用于生产栽培上 也称为三级种 二 菌种生产流程 各级菌种生产 使用基质不一 生产工艺流程有别 大致如下 分离 母种培养基制备 灭菌 接种 培养 筛选提纯 母种 保存 扩繁 原种培养基制备 灭菌 接种 培养 原种 栽培种培养基制备 灭菌 接种 培养 栽培用种 二 常用设备仪器和药品 一 设备食用菌菌种生产流程应呈流水作业 菌种厂应有配料室 灭菌室 冷却室 接种室 培养室 贮藏室等 1 配料室要求地面平整光滑 有水电 并配备下列用具 物品 1 拌料机或拌料槽及拌料 配料工具 2 衡器磅称 工业天平 量杯等 3 分装操作台 台高80cm左右 及分装工具 装瓶机 装袋机 如人工装瓶 需有压板 打孔棒等 2 灭菌室应有灭菌设备 这里专指用于培养基和其他物品消毒灭菌的灭菌锅 1 高压蒸汽灭菌锅 2 常压蒸汽灭菌锅 3 接种设备是指分离和扩大转接各级菌种的专用设备 1 接种室 无菌室 10平方米左右的小套间 拉门 安装紫外灯 内放超净工作台 接种箱等 2 接种箱 3 接种工具 是指分离和移接菌种的专用工具 样式很多 一般用不锈钢制成 主要有接种铲 接种针 接种钩 接种耙 接种枪等 4 培养设备恒温培养箱 恒温培养室 恒温振荡培养箱等 二 仪器和药品 1 仪器 显微镜 干湿温度计 电热干燥箱等 2 药品 乙醇 70 75 石碳酸 5 来苏尔 2 新洁尔灭 0 25 升汞 0 1 高锰酸钾 甲醛 硫磺等 第二节培养基的制备 培养基 人工配制供给食用菌生长发育或积累代谢产物的营养基质 称为培养基或培养料 培养底物 培养基必须具备三个条件 第一 含有食用菌生长所需要的物质 如水分 养分和适宜的酸碱度 第二 具有一定的生长反应 第三 经过严格的灭菌 保持无菌状态 一 培养基的类型 1 按营养来源按培养基的营养来源 可将培养基分为 1 天然培养基 2 合成培养基 3 半合成培养基 2 按培养基的物理状态 可将培养基分为 1 液体培养基 2 固体培养基 3 半固体培养基 二 母种培养基的制备 母种培养基多用试管作为容器 所以又叫试管斜面培养基 常用于菌种分离 纯化 扩大 转管和菌种保藏 1 常用配方 1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 PDA培养基 马铃薯 去皮 200克 葡萄糖20克 琼脂18 20克 水1000毫升 2 马铃薯综合培养基马铃薯 去皮 200克 葡萄糖20克 磷酸二氢钾3克 硫酸镁1 5克 维生素B110毫克 琼脂20克 水1000毫升 以上两个配方适用于培养各种食用菌 3 完全培养基蛋白胨2克 葡萄糖20克 磷酸二氢钾0 46克 磷酸氢二钾1克 硫酸镁0 5克 琼脂15克 水1000毫升 此配方是培养食用菌较常用的合成培养基 有缓冲作用 适用于保藏菌种 4 木屑浸出汁培养基木屑500克 琼脂20克 细米糠100克 硫酸铵1克 葡萄糖 或蔗糖 20克 水1000毫升 此配方适用于木腐菌类的菌种分离与培养 5 玉米粉蛋白胨葡萄糖培养基玉米粉40克 蛋白胨2克 葡萄糖20克 琼脂17克 水1000毫升 此配方适用于培养香菇母种 6 黄豆粉琼脂培养基黄豆粉40克 煮汁过滤 蔗糖20克 过磷酸钙1 5克 磷酸镁0 75克 琼脂20克 水1000毫升 此配方适用于培养木耳母种 7 棉籽壳汁培养基新棉籽壳250克 煮汁过滤 葡萄糖20克 琼脂20克 水1000毫升 此配方适用于培养猴头 黑木耳母种 8 糯米粉糖琼脂培养基糯米粉50克 葡萄糖15克 蔗糖15克 琼脂20克 水1000毫升 此配方适用于培养灵芝 能供菌丝生长 延缓老化结皮 9 改进PDA培养基马铃薯 去皮 200克 葡萄糖20克 石膏粉1克 琼脂20克 蘑菇堆料100 150克 煎汁 水1000毫升 此配方适用于培养双孢蘑菇 2 制作方法 母种培养基种类很多 但制作方法基本相同 其操作步骤如下 第一步 称量溶化 取汁和补水 1 对易溶物质 按配方称取后置于烧杯中 加入其量1 3 1 4的水 搅成糊状 对难溶物质 按配方称取适量水后 加热不断搅拌 促其溶解 2 对去皮切块的马铃薯 黄豆芽 菇类子实体等 按配方称后置容器中 加清水500 1000毫升 料水比1 5 文火煮沸25分钟左右 用4层纱布过滤取汁 3 玉米粉加1000毫升清水 加热到70 左右 保持1小时 用4层纱布过滤取汁 4 对木屑浸出汁所用的去心 带皮木材 切成薄片 加水700毫升 煮沸20分 用4层纱布过滤取汁 所用之米糠加入80 温水300毫升 浸泡30分 用4层纱布过滤取汁 然后将两汁混合 最后均要补足水量到1000毫升 第二步 测定 调整酸碱度 用镊子夹一小段pH精密试纸伸入培养基液中 然后取出与标准比色板比较 过酸过碱用5 的氢氧化钠和5 的稀盐酸调整 第三步 添加琼脂和分装 将称好的琼脂剪成小块 加入配好的液体培养基中 文火煮沸 边加热边搅拌 待琼脂完全溶化后 用湿纱布迅速进行过滤 趁热分装 分装所用的容器要清洗 干燥 分装时要避免培养液粘附试管口 以免培养基粘住棉塞增加污染几率 试管装量 制斜面培养基一般为试管高度的1 5 1 4 制深层培养基一般为试管高度的1 2 1 3 第四步 加棉塞 灭菌 棉塞要用普通棉花制作 不能用脱脂棉 棉塞的大小 松紧要适度 过松达不到滤菌的目的 过紧妨碍空气流通 松紧度以手抓棉塞整个试管能提起为宜 标准的棉塞应是塞头略大 不易变形 塞入试管口2 3厘米 占塞总长的2 3 1 3裸露在试管口外 比管口略大 将塞好棉塞的试管每9 11支捆成一把 用牛皮纸包住棉塞一端 再用线绳扎紧 竖直放入灭菌锅内灭菌 121 3 30分钟 第五步 摆斜面 无菌检查 灭菌锅压力降到0时 开锅取出试管 待其温度降到约60 时即可摆斜面 做法是 在桌面平放2厘米厚的木条 将试管斜放在木条上 培养基冷却后即凝固成斜面 斜面长度一般为试管长度的1 2 无菌检查是将斜面培养基放在37 恒温箱中培养24小时 培养基表面无任何杂菌长出即为合格的培养基 三原种 栽培种培养基的配制方法 原种和栽培种其营养条件相似 制作方法基本相同 原种和栽培种培养基的种类很多1 常用配方 1 木屑培养基以木屑为主料 主要适用于木腐菌的菌种生产 阔叶树木屑78 麸皮或米糠20 蔗糖1 石膏粉1 料水比1 1 3 1 5 阔叶树木屑77 麸皮或米糠20 蔗糖1 5 石膏粉1 尿素0 5 料水比1 1 3 阔叶树木屑98 麸皮1 尿素0 4 碳酸钙0 3 磷酸二氢钾0 2 硫酸镁0 05 高锰酸钾0 05 料水比1 1 3 2 棉籽壳培养基以棉籽壳为主料 是一种应用较广泛的培养基 配方主要有 棉籽壳78 麸皮或米糠20 蔗糖1 石膏粉1 料水比1 1 2 1 4 棉籽壳96 蔗糖2 过磷酸钙1 石膏粉1 料水比1 1 2 1 4 棉籽壳96 麸皮或米糠2 过磷酸钙1 石膏粉1 料水比1 1 2 1 4 3 稻草培养基以稻草为主料 主要适于制作草菇 平菇和凤尾菇等菌种 配方主要有 干稻草97 过磷酸钙1 5 硫酸铵0 5 石膏粉1 料水比1 1 1 1 3 干稻草79 麸皮或米糠或玉米面20 碳酸钙1 料水比1 1 1 1 3 4 玉米芯 花生壳培养基以玉米芯 花生壳为主料的培养基 配方主要有 玉米芯78 麸皮或米糠20 蔗糖1 石膏粉1 料水比1 1 5 玉米芯79 米糠10 玉米粉8 石膏粉1 复合肥2 料水比1 1 5 花生壳78 麸皮或米糠20 蔗糖1 石膏粉1 料水比1 1 5 5 谷粒培养基以小麦 大麦 高粱 玉米 谷子等为主料制作的培养基统称为谷粒培养基 配方主要有 谷粒98 石膏粉1 5 蔗糖0 5 小麦或燕麦98 碳酸钙1 石膏粉1 小麦或谷子93 木屑5 碳酸钙或石膏粉2 玉米粒70 木屑25 麸皮4 石膏粉1 小麦粒72 棉籽壳25 黄豆粉2 石膏粉1 2 制作方法 1 配制按配方称取原料 先将易溶物质溶于适量水中 其它原料进行混合 干拌后 加入易溶物质的溶液进行搅拌 要求充分拌均匀 干湿一致 含水适中 使料的含水量达到60 65 稻草 玉米芯 花生壳 谷粒等用前应进行处理 稻草应切成2 3厘米小段浸于水中1天 使其吸足水分后捞出沥至不滴水 含水量约65 玉米芯 花生壳先碾碎 然后放于pH值为10 11的石灰水中浸泡12小时 捞出用清水冲洗并沥至不滴水 谷粒先放入水中浸泡 使其吸足水分 浸水时间因气温而定 一般天热浸16小时 天冷浸24小时 捞出用清水冲洗后 置沸水锅中煮沸15 20分钟 至谷粒吸足水分但又不过分膨胀和开口为度 然后用清水冷至常温 沥去多余水分 剔除 破肚 2 分装装瓶前必须将空瓶洗干净 干燥 培养基配好后 即可分装 一边装一边振动并用木棒压紧 使装入的培养基上下松紧一致 装至瓶肩为止 料面压平 在培养基中间用圆锥形捣木打一洞 直到瓶底 有利菌丝蔓延 用清水洗净瓶口粘着的培养基 并把瓶身也洗抹干净 盖好瓶口即可灭菌 生产栽培种时 多采用塑料袋作为容器 高压灭菌用聚丙烯塑料袋 常压灭菌用聚乙烯塑料袋 装袋一般用装袋机 袋口擦净套塑料环 塞上棉塞 棉塞外可包扎牛皮纸或防水纸 3 灭菌原种采用高压蒸汽灭菌 栽培种塑料袋据材料可采用高压或常压灭菌 灭菌时间根据灭菌方法和培养基材料的种类来决定 一般高压灭菌压力0 137兆帕 120分钟 常压灭菌在98 100 保持6 8小时 培养基灭菌完毕从锅中取出后 应放在冷却室内冷却 准备接种 3 注意事项 第一 木屑系指阔叶树木屑 新鲜的和陈的均可 针叶树和具有芳香 异味的树种木屑不宜用 第二 米糠系指细米糠 不能用稻壳代替 米糠和麸皮都要用新鲜的 变质结块的一律不能用 第三 各种成分必须按配方准确称取 不可随意增减 更不可随意添加一些抑菌剂 第四 拌料 分装至灭菌锅温度达到100 时间越短越好 拌料加水后 各种微生物就开始活动 生长繁殖 因此 要求从加水拌料到分装上锅灭菌 时间不要超过6小时 常压灭菌上锅后火力要猛 争取在4 6小时内使锅温达到100 时间长了会导致培养基酸败 第三节消毒与灭菌 微生物是形体微小的生物 它包括病毒 立克次氏体 细菌 放线菌 酵母和霉菌等 自然界中到处都有微生物存在 为了得到食用菌的纯培养物 就必须在一定范围内彻底杀灭空气及物料 容器 工具等中的一切微生物 常用的灭菌方法有物理灭菌和化学灭菌法两大类 一 物理灭菌 指用高热 辐射 过滤等手段除微生物的方法 常用的灭菌方法有 1 干热灭菌法 是利用干燥箱中热空气造成高温环境灭菌 这个方法适用于玻璃器皿 金属工具等固体器皿的灭菌 除液体石蜡外 一切液体均不能用此法灭菌 通常有两种灭菌法 一是接通电源 徐徐使烘箱升温至160 180 并保持两小时就能达到灭菌目的 如用此法超过180 所灭纸张或棉花就会焦化 影响灭菌质量 另一方法是使烘箱升温160 以上时 可关闭烘箱的通风孔 切断电源 待烘箱内温度降至50 以下 就能达到杀菌目的 2 高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽的温度可超过常压下沸点 100 的温度 一般0 1兆帕压力可达温度121 3 又因为蒸汽热穿透力强 故可迅速引起微生物蛋白质凝固 因此 高压蒸汽灭菌方法是一种较好的灭菌方法 食用菌生产中往往用这种方法灭菌制备一 二级菌种用的培养基 使用本法灭菌注意升压前要排尽锅内冷空气 也就是锅内水沸腾后 蒸汽温度100 以上 可继续排冷空气5分钟左右 一般可排尽冷空气 另一排尽冷空气法 可使锅内压力升压至0 05兆帕压力时 放气 使压力降至零 再关闭排气阀 也可排尽冷空气 如不排尽冷空气则达不到灭菌效果 虽然压力高但达不到相应的温度 因此灭菌效果不佳 其次 应注意上升至要求压力后 要保持一定时间 然后断电或撤下热源 待温度降至零时再放汽开锅 如果不这样会造成灭菌不彻底或者容器内液体喷出 3 蒸锅灭菌法 食用菌生产中常用大锅蒸料灭菌 一般采用100仞大锅 四周围用砖水泥砌一圆或方形的锅围子 高1 1 5米 在大锅内放一帘子 待锅内水沸腾后 在帘上见汽撒料 当料全部撒完后 再盖上盖或用塑料盖上并扎紧 蒸2个小时就可以达到灭菌的目的 4 紫外线灭菌紫外线中波长为2000 3000 具有杀菌作用 一般紫外线灯为2537 其杀菌力强而稳定 由于细胞中DNA吸收了这一波长 轻则发生变异 重则造成死亡 因此 调节紫外线照射的距离和时间 可以诱变育种 也可以杀菌 食用菌生产当中 多在无菌室 无菌箱中安装紫外线灯 利用紫外线进行消毒 二 化学灭菌 1 酚类常用的石炭酸 又名苯酚 石炭酸能溶于水 有特殊气味 浓石炭酸能使皮肤变白 手指麻痹 并可损坏皮肤与粘膜 因此 它对人畜有毒 通常使用3 5 的水溶液作为喷雾剂处理无菌室 箱 或对器械浸泡消毒 它对金属无腐蚀作用 能杀死细菌芽孢而对真菌孢子杀伤作用不大 有氯化钠存在时酚的药效增加 有乙醇存在时则药效大减 石炭酸杀菌原理 它能使细胞膜损害 使蛋白质变性或沉淀 因此 它杀菌力较强 常用作比较杀菌力的标准 来苏尔系用肥皂乳化的甲酚 它的杀菌效力比苯酚大4倍 常用3 5 的溶液来消毒皮肤 桌面及用具 2 甲醛甲醛是气体 易溶于水 通常使用37 40 的甲醛溶液 即福尔马林 它的杀菌力比石炭酸强 常用甲醛来消毒无菌室或箱等 每立方米空间用10 15毫升甲醛熏蒸就可达到消毒的目的 具体做法是在坩埚 或培养皿 加入甲醛溶液 然后用酒精灯熏蒸或在甲醛内加入高猛酸钾 约5克 立方米 任其反应挥发 关上门窗闷一夜 就能起到消毒灭菌作用 甲醛的杀菌机理是 甲醛和菌体蛋白 包括酶 的氨基结合 使蛋白质凝固变性 3 乙醇一般用70 75 浓度 其杀菌效果最好 高浓度乙醇杀菌能力反而下降是因为高浓度乙醇遇到微生物细胞时 很快使细胞表面脱水 形成一层保护膜 乙醇不能渗透到细胞内 也不能使蛋白质凝固 所以高浓度乙醇反而杀菌效果差 如果在乙醇中加入稀酸或稀碱则杀菌效力增加 乙醇能减低酚 甲醛等的杀菌效力 但能增强碘及升汞的杀菌效力 一般乙醇用于皮肤及器械消毒 菌种分离时 常用乙醇作为表面消毒剂 4 新洁尔灭它是季胺类的表面活性剂 一般可将原液稀释1倍 对器械或手 皮肤及不能遇热的器具进行消毒 5 石灰它分为生石灰 CaO 与熟石灰 Ca OH 2 两种 起杀菌作用的是熟石灰中的氢氧离子 它能水解蛋白质和核酸 使微生物体的酶系和结构受到损害 并能分解菌体中的糖类 因此 碱能杀菌 生石灰遇水变成熟石灰 如果熟石灰常时间暴露在空气中 它吸收空气中的二氧化碳而变成无效的碳酸钙 一般1 3 的石灰水溶液就可起到良好的杀菌作用 6 内吸杀菌剂如 苯来特 多菌灵 涕必灵 麦穗宁 甲基托布津等等 它们在离体条件下具有高度活性 对细菌没有活性 主要对霉菌有抑制作用 杀菌机理主要是干扰核酸合成及细胞分裂 从而达到杀菌目的 一般用量为0 02 0 1 对人畜无害 一般是将其添加到培养料中 由于食用菌种类不同 选择药物也应有不同的种类与浓度 三 无菌操作及要点 在严格的消毒灭菌条件下进行的菌种移植操作称为无菌操作 虽然各级菌种的接种有所差异 但无菌操作的基本要点是相同的 1 接种空间一定要彻底地消毒灭菌 2 菌种所暴露或通过的空间必须是无菌区 3 菌种管口 瓶口的部分必须用酒精灯火焰封闭 4 各种接种工具和菌种接触前都应该经火焰灼烧灭菌 冷却后再接种 以免烫死或烫伤菌种 5 棉塞塞入管口或瓶口的部分 拔出后不要与未经灭菌的物体接触 6 每次接种的时间不宜过长 以免空气中杂菌的基数不断地积累 影响转管 接种效果 7 操作人员最好换消毒的工作服 戴口罩 双手要用70 75 的酒精消毒 8 不带口罩操作时要尽量少说话为宜 9 整个操作过程动作必须迅速无误 时时刻刻树立无菌观念 第四节菌种分离 通常采用的菌种分离方法有 孢子分离法 组织分离法和基内菌丝分离法三种 一 孢子分离法孢子是食用菌的基本繁殖单位 孢子分离法是利用成熟子实体的有性孢子 担孢子或子囊孢子 能自动从子实层中弹射出来的特性 在无菌条件下和适宜的培养基上 使孢子萌发成菌丝 获得纯种的一种方法 有性孢子具有双亲的遗传性 生活力强 数量多的特点 因此采用孢子分离法 从中选择优良菌株的机会较多 所得的菌种菌龄小 生活力旺盛 二 组织分离法 组织分离法是利用子实体组织来分离获得纯种的方法 食用菌子实体组织 实际上就是菌丝体的扭结物 具有很强的再生和保持种性能力 切取一小块组织移植到培养基上便能进入营养生长阶段 从而获得纯菌丝体 采用组织分离法培养 操作简便 取材广泛 无论是幼子实体或成熟子实体 只要新鲜 即使取其菌柄也能分离培养成菌种 也是野外采种常用的方法之一 只是对于子实体小 薄及胶质种类不太适用 根据分离材料的不同 大体可分为以下几种 1 伞菌类的组织分离从优良品系中选取优良的个体作种菇 以单菇 朵大 盖厚 无病虫危害的菌蕾作为分离材料 把幼菇根部带泥部分切除 置接种箱内 用无菌水冲洗几次 并用无菌纸吸干 然后以75 乙醇进行表面消毒 用消过毒的解剖刀在菌柄或菌盖中部纵切一刀 掰开菌伞 挑取菌盖与菌柄交界处的一小块组织 接到PDA斜面培养基上 置25 左右温箱内培养3 5天 组织块上即可长出白色绒毛状菌丝 说明分离成功 对一些个体细小的伞菌子实体 如金针菇 可采用子实层作组织分离材料 其方法是 选尚未开伞的菇蕾 在无菌箱内以0 1 的升汞液浸1 2分钟 再用无菌水冲洗 揩干 或用75 酒精棉球擦菌盖2次 进行表面消毒 然后开菌盖或用解剖刀剖开菇蕾 露出白色菌褶 用接种针挑取1 2片菌褶 接种到斜面培养基上 在23 左右下培养1周 菌丝就可长满斜面 2 胶质菌类的组织分离黑木耳 毛木耳等胶质菌 因子实体组织层较薄 质地较韧 且菌丝数量极少 故进行组织分离的难度较大 分离时无菌操作剖取尚未展开的耳片胶质团内部的组织块 直接置于PDA斜面上进行培养 也可将耳片用75 酒精浸泡1分钟 再用无菌水漂洗3次 并用无菌纸吸干后 剪成7 4mm小块 置于加25 乳酸3滴的PDA培养基平板上 每皿5块 适温培养 3 菌核组织分离法茯苓 猪苓 雷丸等的子实体不易采集 而它们的营养贮藏结构 菌核 易获得 利用菌核分离 同样能得到该菌的菌种 分离时先把菌核表面洗净 吸干带入无菌箱内 以75 乙醇进行表面消毒后 用无菌解剖刀把菌核切开 取中间组织一小块 黄豆大小 移入PDA斜面上 于25 下培养 4 菌索组织分离法蜜环菌 假蜜环菌 安洛小皮伞等在培养基内产生菌索 分离时 将菌索洗净后用纱布吸干水分 置接种箱中 用75 乙醇进行表面消毒 再用无菌解剖刀切断 抽出白色的菌髓 用尖头镊子夹取一小段 接入试管PDA斜面上 于23 25 下培养 为防止细菌污染 可在培养基里加入抑菌的青霉素或其它抗生素 使用浓度为0 04ug L 三 基内菌丝分离法 在进行食用菌资源调查中 常会遇到某些希望得到的子实体 但却已经腐烂了 或有些子实体个体小而薄 或采用组织分离和孢子分离均困难 就可以采用基内菌丝分离法 还有一些菌类 如银耳菌丝 只有与香灰菌丝生长在一起才能产生子实体 如果要同时得到这两种菌丝的混合种 也只能采用基内菌丝分离法 归纳起来有以下两种 1 耳 菇 木分离法 此法必须是在出耳 菇 季节进行 把采集到的耳 菇 木在长子实体的两侧 锯下约1cm厚的木片 置接种箱里 再从耳或菇基穴的周围 切取一个三角块 浸在0 1 升汞溶液中 表面消毒30 60秒钟 取出并用无菌水冲洗 再用无菌纱布吸干水分 移至另一块无菌纱布上 用无菌解剖刀切除树皮后把木片劈成比火柴梗略粗的小块 接入试管PDA斜面培养基上 置22 25 下培养 2 土中菌丝分离法 是利用菌类地下的菌丝体分离获得菌种的方法 主要用于土中菇类 用前述分离方法能获得菌种的一般不用这种方法 但在野外采集时 如菇类子实体已腐烂 可采用此法 操作方法如下 1 取菇体下与菇根相连的菌丝体 尽可能取较清洁的菌丝束 2 用无菌水反复冲洗菌丝束 然后用无菌棉花吸干水分 3 取菌丝束尖端部分 接种到加有细菌抑制剂的培养基中 4 置于25 的恒温箱培养 5 菌丝的鉴定 在土中获得的菌种 其可靠性较小 必须经过出菇鉴定才能确定是否是该菌菌种 第五章菌种质量鉴定 优良菌种是食用菌栽培达到优质高产的前提 因此在生产中 必须把好菌种质量关 一 优质菌种的标准食用菌优质菌种的标准 随品种不同而有差异 总的来看 一个优良的菌种应该达到 纯 正 壮 润 香 的标准 具体要求是 纯 菌种的纯度高 不能感染有任何杂菌 正 菌丝色泽要纯正 多数种类的菌丝应洁白 有光泽 原种 栽培种菌丝应相连接成块 而不松散 无老化变色现象 壮 菌丝健壮 分枝浓密 生活力强 接到新的培养基上吃料快 长势好 不萎蔫 不衰老 不死亡 润 培养体湿润 与瓶壁紧贴而不干缩 含水量适宜 香 具有一定的清香 不得有霉腐气味 二 菌种鉴定方法 1 直观法用肉眼直接观察菌种 看包装是否合乎要求 棉塞有无松动 试管 玻璃瓶 塑料袋是否破损 有无病虫害浸染 色泽是否正常 有无老化现象 再打开瓶塞 从菌种瓶中部取出小块菌丝体 观看颜色 闻其气味 手捏料块检查其含水量 看是否符合上述标准要求 直观法比较简单 但鉴定人必须要有实践经验 2 镜检法选取少量菌丝制片 在显微镜下观察分枝 分隔 锁状联合及孢子 对细胞结构进行鉴定 但品系之间的差别 镜检难以解决 3 培养观察对分离或引进的菌种 通过培养菌丝 观察其在偏干 偏湿及干湿适宜条件下的生长情况 以及耐高温测试 以确定菌种生活力及适应环境能力 4 出菇试验对分离或引进菌种 在用于生产前必须做出菇试验 根据条件采用瓶栽 压块栽培出菇 观察出菇能力 做好生物学记录 通过产量和质量分析 才能推广应用于生产 三 几种主要食用菌菌种鉴别标准 1 平菇 1 母种菌丝洁白 浓密 粗壮 生长整齐 不产生色素 菌丝生长快 在适温下6 8天可长满试管斜面 气生菌丝爬壁力强 菌丝粗壮 生长整齐 气生菌丝少 有菇香的为优良菌种 气生菌丝多 形成很厚的菌被将管壁包满 是老化菌种或多次无性繁殖的菌种 很容易在种块或管壁上形成原基 不宜扩大培养 2 原种 栽培种菌丝密集 洁白 长势均匀 粗壮 呈绒毛状 有爬壁现象 在培养基表面有少量珊瑚状小菇蕾出现 菌龄以20 25天为宜 2 香菇 1 母种菌丝洁白 粗壮 呈绒毛状 平铺生长 生长速度中等 适温下12 14天可长满试管斜面 略有爬壁现象 有的品种可以形成原基 2 原种 栽培种菌丝粗壮浓密 生长均匀 洁白有光泽 香味浓郁 很少产生厚菌被 容易形成较多的子实体 菌龄35 40天 3 黑木耳 1 母种菌丝白色 短 密 整齐 平贴于斜面培养基上 不爬壁 生长速度较慢 有些品种可产生次生孢子 使培养基表面的菌丝体带有粉末状物 有些品种在斜面培养基上能形成小原基 菌丝长满斜面后 若出现黄斑 培养基逐渐变成褐色 浅黑色 说明菌种已老化 2 原种 栽培种菌丝洁白粗壮 长势旺盛 全瓶均匀一致 培养后期 40天左右 瓶壁自上而下可见少量菊花或梅花状的胶质原基 颜色是黄褐至黑褐色 菌龄以35 40天为宜 4 滑菇 1 母种菌丝棉绒状 较短 气生菌丝不繁茂 最初白色 后变为奶油黄色 淡黄色 管壁常出现网状菌丝束 产生黄褐色色素 生长速度较慢 在适温下培养12 15天可长满试管斜面 2 原种 栽培种菌丝浓密 洁白 呈棉絮状 上下均匀 富有弹性 培养基变淡黄色或白色 均匀一致 为优质菌种 菌丝虽为白色 但不呈绒毛状 无弹性 捏碎成小块或粉状 培养基呈黄褐色或暗褐色 为菌龄过小的菌种 要继续培养 瓶底有黄白色或褐色液体 为老化菌种 不宜使用 四 菌种老化 退化及产生原因 1 老化老化是由于菌龄太长或营养不足 环境不适 保存不善而引起菌丝生活力降低的生理现象 一般表现为生长缓慢 菌丝倒伏 颜色变黄等 2 退化是指菌丝活力和产量逐代降低的遗传现象 3 菌种老化退化原因 1 多次移接 2 水质的影响 3 温度 4 长期处于逆境 5 自然变异 6 感染病毒 第六章菌种保藏 菌种是重要的生物资源 也是食用菌生产首要的生产资料 一个优良菌种被选育出来以后 必须保持其优良性状 防止被杂菌污染 才不至于降低生产性能 能长期在生产上使用 因此 保藏菌种和选育菌种具有同样重要的意义 菌种保藏的基本原理是采用干燥 低温 冷冻 减少氧气供给等方法 以终止其繁殖 降低代谢速度 使菌丝处于休眠假死状态 并保证原种的纯度 常用的保藏方法有以下几种 一 斜面低温保藏法斜面低温保藏 又叫定期移植保藏法 是常用的最简便的保藏法 将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上 培养到接近成熟后 放在4 5 的冰箱中保藏 用此法保藏菌种 因温度不够低 只有4 左右 微生物的代谢活动并未停止 试管斜面还容易失水变干 保藏时间较短 一般每隔3 4个月需移植一次 几乎所有的食用菌 除草菇外 都可以使用这种方法保藏菌种 草菇是高温性菌种 在5 以下菌丝体容易死亡 需要提高到10 13 保藏 利用此法保藏菌种 应尽可能使菌丝体在培养基上不干 不死 以延长保藏时间 为达到此目的 需注意以下几点 1 适当加大琼脂用量琼脂具有保水功能 在配制保藏用培养基时 为了减少培养基水分蒸发 延长保藏时间 可将琼脂用量由2 加大到2 5 2 矿油封口菌种培养成熟后 为减少培养基水分的散失 最好将试管棉塞从管口处剪平 用石蜡封严后 再包扎一层塑料薄膜 以延长保藏时间 3 加大培养基用量保藏菌种培养基用量 每管不少于12毫升 以延缓水分的损耗 4 加酸度中和剂为防止菌种在保藏过程中产生的酸积累过多在配制保藏培养基时还需加入0 2 0 3 的磷酸二氢钾或碳酸钙等缓冲剂 以中和菌种在保藏过程中产生的有机酸 5 减少冰箱开启次数为保持冰箱的稳定 不要随意过多地打开冰箱 在条件允许下 设置一个永久的保藏冰箱 与经常用菌种的冰箱分开使用 6 定期调换配方在菌种保藏过程中 一般应每隔一定时期 调换1次培养基配方 以补充营养 水分 消除菌丝体代谢产物的影响 保持菌种正常的生活能力 二 矿油保藏法 矿油 主要是液体石蜡 保藏 又称液体石蜡覆盖保藏 用此法保藏 不需要太多的设备 操作简便 只需在菌苔上灌注一层无菌的液体石蜡 即可使菌种与外界空气隔绝 达到防止培养基水分散失 抑制菌种新陈代谢 延长保存时间的目的 一般室温下可保藏5 7年 期间1 2年应移接1次 用此法保藏的菌种不必置于冰箱内 室内保藏即可 1 矿油处理选用化学纯的液体石蜡 要求不含水 不霉变 分装于三角烧瓶中 装至瓶体的1 3处 加棉塞封口 在0 103兆帕压力下灭菌1小时 由于高压蒸汽灭菌常有水蒸气渗入 需放在40 温箱中烘烤8 10小时 使水分蒸发至石蜡液透明为止 2 灌注矿油用无菌吸管将灭菌石蜡液注入在要保藏的菌种斜面试管内 用量以高出斜端1厘米为宜 然后将棉塞齐口剪平 再用蜡密封管口 3 活化培养刚从石蜡油菌种中移出的菌丝体常沾有少许矿油 生长较弱 因此 需要再移植一次 才能恢复生长 也可用接种工具从斜面上取一小块菌丝先在无菌水中洗涤 然后移接于斜面培养基上即可 余下的种可重新封口继续保藏 三 冷冻干燥贮藏法 此法是采用真空 干燥和低温3种手段来保藏菌种 菌种保藏期可达10 20年 仍不降低其原有性能 是目前应用最广泛 效果较好的孢子贮藏方法 1 冷冻管准备选用中性玻璃吹制的10毫米 100毫米 底端突出球状的安瓿管 用0 02摩尔 升盐酸浸泡8 10小时 冲洗至中性 烘干 在管壁贴上标签 标明菌名 日期等 加棉塞 干热灭菌 2 制备孢子悬浮液在试管中加入3毫升脱脂牛奶加棉塞 121 灭菌30分钟 在无菌条件下放入食用菌孢子 搅动制成孢子悬浮液 用无菌的长毛细滴管吸取孢子悬浮液注入安瓿管底球部 每管约0 2毫升 分装时不要沾污管壁 塞好棉塞 3 速冻干燥将安瓿管放在 40 30 低温冰箱内预冻1小时 防止抽气时产生泡沫外溢 也可将安瓿管置1 1的干冰和95 的乙醇组成的冻结剂内 预冻3 4分钟 然后戴上防冻手套 将安瓿管壁擦干净 立即放入真空干燥器内抽真空 真空度用麦氏真空计测量 要求30分内达93 3帕 继续抽气 使真空度维持在26 6帕 经6 8小时后 即可使管内水分升华干燥 4 真空熔封将安瓿管安装在抽气管上抽气熔封 真空度达26 6帕时 边抽气边用单火焰或双火焰将安瓿管上端熔断封口 熔封后 检查安瓿管是否漏气 5 保藏和启用置4 6 冰箱内或常温下遮光保藏 使用时 在无菌条件下用砂轮把安瓿管上端划一刻痕 置火焰上加热 再把蘸有来苏尔的纱布敷上 使之破裂 然后管内注入0 5毫升无菌生理盐水 用接种环移接入斜面上活化培养 四 液氮超低温保藏法 是根据活细胞在超低温下 196 处于休眠状态而设计的一种长期保藏菌种的方法 由于超低温能使代谢水平降到最低限度 用此法保藏的菌种基本上不发生变异 是目前保藏菌种的最好方法 1 保藏方法采用10 体积比 的二甲基亚砜蒸馏水为保护剂 淹没料面 轻轻地刮落面料上的菌丝体 使之成菌丝悬浮液 吸取5 8毫升注入已灭菌的安瓿管中 熔封管口 放液氮冷冻器内 以每分钟降低1 的速度缓慢降温 在1小时内使其冻结到 35 以后速度不需控制 当安瓿管冻结后 立即放入液氮罐中 罐内的气相温度为 150 液体温度为 196 2 活化培养在启用液氮超低温保藏菌种时 应先将安瓿管置于35 40 的温水中 使管中的冰块迅速溶解 然后再开启安瓿管 取悬浮的菌丝块移植于适宜的培养基上活化培养 五 自然基质简易保藏法 1 麦粒保藏法用麦粒保藏蘑菇和灵芝菌种 保藏期蘑菇达一年半 而灵芝可达5年之久仍有活力 麦粒保藏法是利用麦粒作培养基 用于保种的麦粒 含水量在25 左右 这样的麦粒 在灭菌后种皮不破裂 制作方法 先将麦粒浸水4 5小时 滤去水后晾干麦粒表面的水分 装入小试管 装量为试管高度的1 3 高压蒸汽灭菌 在0 137兆帕压力下 灭菌1小时 冷却后接入孢子液或菌丝悬浮液 摇匀后置适宜温度下培养 当试管中的麦粒发满菌丝后 放入装有氯化钙的干燥器内 进行抽气干燥 干燥后 将干燥器放于20 以下的温度保藏 此法保藏菌丝 经1 2年后 再接到培养基上 菌丝生长仍然良好 2 木屑保藏法采用木屑麸皮培养基 装入试管长度3 4后 擦洗干净 管口塞好棉塞 捆扎后 在0 137兆帕压力下灭菌1 5小时 取出接种后 在25 恒温下培养 待菌丝长到培养基2 3时 取出用蜡将棉塞封好 包上塑料薄膜 置于4 冰箱内 保藏1 2年 使用时 从冰箱取出后在25 恒温箱内培养18 24小时 在无菌条件下去掉试管上部的菌种 取下部较新鲜的菌丝体 接入斜面培养基即可 此法适用香菇 黑木耳 黄背木耳菌丝保藏 3 草粉保藏法稻草粉碎后加入30 麸皮 pH值调到8左右 分装入试管内 装量为管长的2 3左右 在0 137兆帕压力下灭菌1 5小时 接入草菇菌种适温培养 菌丝长满管后 在接种箱内 换上无菌橡皮塞 置8 以上室温下保藏 用此法保藏草菇菌种 可达1年以上 六 干燥保藏法 1 沙土管保藏法此法是将食用菌孢子保藏于干燥的无菌沙土中 保藏期为2 10年 具体方法如下 第一 取河沙过筛 60 80目筛子 除去大沙粒 用10 的盐酸浸泡以除去有机质 盐酸用量以淹没沙面为宜 浸泡2 4小时后 倒去盐酸 用清水冲洗几次 直到接近中性 置60 80 烘箱中烘干 第二 沙土比例为2 1或4 1 装于小试管中 装入量以0 5 1厘米高为宜 洗净试管 塞好棉塞 在0 137兆帕压力下灭菌30分钟 需重复进行3次 如采用干热灭菌在165 下保持2 3小时 1次即可 灭菌后取少许干沙土放入牛肉汤培养液中无菌培养 检查无菌 证明沙土管灭菌彻底合格后 方可使用 第三 用接种环将收集的孢子接于沙土管中拌匀即可 或将孢子接于5毫升无菌水的试管中 充分摇匀成孢子悬浮液 然后用1毫升无菌吸管吸取孢子悬浮液加入沙土管中 每管加0 2毫升 即可 第四 将接种后的沙土管置于盛有干燥剂 生石灰 氯化钙或硅胶 的容器内 接上0 5千瓦的真空泵抽气约8小时 使沙土基本干燥 第五 经抽样检查 证明无杂菌生长 即可封口进行保藏 2 滤纸片保藏法此法适用于蘑菇 金针菇 香菇 黑木耳和猴头 用滤纸片保藏孢子 可存活1 5年 1 滤纸片准备将白色或黑色滤纸片剪成宽0 2 0 3厘米 长0 5 8厘米 整齐地平铺在大培养皿底 直径15厘米 盖上皿盖 并用牛皮纸包好 在0 103兆帕压力下灭菌30分钟 然后在烘箱中稍加烘干 2 孢子收集将灭过菌的滤纸片培养皿移入接种箱孢子采集罩内 接受孢子 3 贮藏方法待孢子弹射上滤纸片后 在无菌条件下 用镊子将纸片一一移入无菌空试管中 然后将试管封熔保藏在0 1 冰箱内 七 悬液保藏法 1 生理盐水保藏法将保藏的食用菌菌种 在无菌条件下接入马铃薯汁蔗糖培养液中 振荡培养5 7天 然后将形成的菌丝球吸入装有5毫升无菌生理盐水的试管中 每管移入4 5个菌丝球 塞好试管 并蜡封 置于常温或4 温度下保藏 一般可保藏1 3年 2 菌丝体液体保藏法将保藏的菌种在无菌条件下 取菌块放入马铃薯培养液中 在常温下静置培养 其成活率达33个月为91 9 42个月为88 9