【病毒外文文献】1987 _tude compar_e de trois souches du coronavirus de la gastroent_rite transmissible_ Conditions de la r_plicationvira

ELSEViER Paris 1987 Ann Inst Pasteur Virol 1987 138 315 330 ETUDE COMPAREE DE TROIS SOUCHES DU CORONAVIRUS DE LA GASTROENTERITE TRANSMISSmLE CONDITIONS DE LA REPLICATION VIRALE ET DE LA SYNTHESE DES ANTIGENES STRUCTURAUX par T D Nguyen S Bernard E Bottreau I Lantier et J M Aynaud INRA Laboratoire de Pathologie Porcine 37380 Nouzilly France SUMMARY COMPARISON OF THREE STRAINS OF THE TRANSMISSIBLE GASTROENTERITIS CORONAVIRUS TOEV VIRAL REPLICATION AND SYNTHESIS OF STRUCTURAL ANTIGENS Purdue 115 and D 52 strains of TOEV were compared with the 188 S0 strain which was obtained by means of a survivor selection process in gastric juice of adult pig The 188 S0 strain was characterized by a low infectivity b delayed and restricted growth associated with low and delayed RNA syn thesis and c a high content of structural antigens In contrast Purdue l 15 and D 52 strains were characterized by a high infectivity and b a normal pattern of virus replication and RNA and structural antigen synthesis Tunicamycin induced the inhibition of synthesis of El and E2 glycoproteins detected by the ELISA test using monoclonal and polyclonal antibodies as well as a significant reduction in the NP protein The inhibitory effect of tunicamycin was influenced by the cell type and virus strain KEY WORDS Coronavirus Transmissible gastroenteritis Antigen Tunicamycine Strains Replication ELISA Infectivity Pig Manuscrit soumis Ie 30 aout 1986 accepte Ie 19 mars 1987 Adresse actuelle Institut National de Recherches Veterinaires Nga Tu Vong Dong Da Hanoi Vietnam Auteur a qui les demandes de tires a part peuvent etre adressees 316 r o NGUYEN ET COLL INTRODUCTION La gastroenterite transmissible GET est une enterite neonatale mortelle hautement contagieuse causee par un coronavirus specifique de l espece por cine Ia GET est responsable de lourdes pertes economiques en production porcine La relation entre Ie pouvoir pathogene du virus et d eventuels mar queurs in vitro lies par exemple aux conditions de sa replication fait encore l objet de controverse 9 11 14 17 Apres un certain nombre de passages en serie sur culture cellulaire le virus OET perd une grande partie de son pouvoir pathogene Des resultats recents suggerent qu Il n est pas possible de distinguer la souche attenuee 188 S0 utilisable comme vaccin vivant oral chez la truie en vue de l induction de l immunite lactogene des souches D 52 dont la souche 188 S0 tire son origine et Purdue 115 souche americaine de reference par l etude des conditions d attachement in vitro des particu Ies virales Ann Rech veterin 1987 sous presse C est pourquoi nous avons entrepris l etude comparee de la replication de ces trois souches de virus GET dans deux systemes cellulaires differents les cellules ST testicule de pore et les cellules RPD rein de pore Nous avons con centre nos efforts d une part sur l etude de la cinetique des syntheses virales et d autre part sur l analyse des antigenes structuraux du virus produit ala fin du cycle al aide d une batterie d anticorps mono clonaux specifiques du virus OET La resistance de la souche 188 S0 al aci dite et aI action des enzymes proteolytiques 1 suggere l existence probable de changements structuraux ou conformationneIs qui pourraient etre lies aux conditions de glycosylation des proteines virales C est pourquoi nous nous sommes aussi interesses aI influence d une substance connue pour son acti vite a ce niveau la tunicamycine MATERIEL ET METHODES Cellutes La lignee de cellules de rein de pore RPD a ete decrite precedemrnent 14 La lignee de cellules de testicules de pore ST 16 a ete fournie par le Dr E H Bohl Wooster Ohio USA Ces cellules sont cultivees en milieu MEM milieu essentiel minimal additionne de serum de fcetus de veau 10 Souches de virus de la GET La souche Purdue US qui a subi 115 passages sur cultures cellulaires a fait I objet de nombreuses publications 3 8 14 19 La souche D 52 a ete obtenue apres cinq GET MEM gastroenterite transmissible milieu essentiel minimal p i post infection TROIS SOUCHES DE CORONA VIRUS DE LA GET 317 passages sur culture de rein de pore apartir d une souche sauvage virulente isolee en France apartir d un foyer de GET 114 La souche 188 SG a ete obtenue apartir de la souche D 52 par selection de survie apres 188 passages dans du contenu gastri que de pore alternes avec des passages sur cultures cellulaires 1 Pour chacune de ces trois souches des stocks viraux ant ete prepares sur cultures monocouches de cellules RPD flacons Falcon de 150 cm apres 18 h d incubation p i post infection a 37 C Les stocks de virus sont conserves a 70 C Titrage du pouvoir infectant du virus de la GET Le pouvoir infectant du virus GET est titre a l aide de la methode des plages sur cellules ST cultivees en monocouche dans des plaques plastiques Costar a six cupules Les plages sont visibles sous l agarose apres deux jours d incubation des cellules infectees a37 C en presence de CO 2 a5 5 070 La numeration des plages est realisee apres coloration par Ie rouge neutre 10 4 p v Cinetlque de la synthase de l ARN des proteines et de la formation virale en cycle unique Decrite precedemment 1 la technique pour I etude du developpement du virus en cycle unique a He reprise pour examiner la synthese de l ARN et des proteines et la formation des particules infectieuses virales Les modifications suivantes ont ete apportees apres l attachement du virus 1esinoculums ont ete elimines par deux lavages Le milieu MEM additionne de 1 ug rnl d actinomycine D et de 0 2 fiCi ml d uridine au de leucine tritiees a ete utilise pour la culture des cellules infectees qui ant ete ensuite mises aincuber a37 C Preleves en fonction du temps les echantil Ions 0 1 ml chacun ant ete deposes sur des papiers filtre Titertek cell harvester filter Flow Laboratories Apres trempage pendant 1 h it 4 C dans de l acide trichloroacetique 5 070 ces papiers sont rinces trois fois avec de l alcool a70 et seches La radioactivite de l uridine au de la leucine tritiee incorporee dans les macromole cules a ete mesuree al aide d un compteur it scintillation LKB Par ailleurs les echan tillons ainsi preleves ant ete stockes amains 70 C pour titrage du pouvoir infectant du virus GET Ultracentrifugation isopycnique du materiel viral present dans les cultures cellulaires it la fin du cycle 18 h p i Un millilitre de la suspension virale de chaque souche est depose sur un gradient continu de saccharose l0 50 070 en tampon TESV Tris HCl 0 02 M pH 7 4 EDTA 0 I M NaCI 0 1 M Apres 14 h de centrifugation a80 000 g dans un rotor SW 27 Beckman des fractions de 1 ml sont collectees et analysees Les titres infec tieux la quantite d ARN DO a 254nm la quantite de proteine DO a 280nm et l activite antigenique ELISA sont determines pour chaque fraction du gradient Influence de la tunicamycine sur la multiplication vlrale Les tapis cellulaires dans les plaques plastiques asix cupules Costar ant ete infectes avec du virus GET araison de 5 a8 UFP cellule Apres 60 min d absorption it 37 C l inoculum est elimine par deux lavages et remplace par 3 ml de milieu MEM addi tionne de tunicamycine Sigma it differentes concentrations de 0 a5 ug rnl Apres 18 h d incubation a 37 C en presence de CO 2 a 5 5 0J0 les cultures sont congelees et decongelees et le titre du virus recolte est determine par la methode des plages 318 t o NGUYEN ET COLL Les antigenes viraux neoforrnes sont titres al aide d un test ELISA L effet inhibi teur de la tunicamycine sur Ie rendement de la multiplication virale est exprime par la baisse du titre infectieux et de la densite optique pour le test ELISA Titrage des antlgenes structuraux du coronavirus GET it I aide d une technique ELISA mixte Anticorps monoclonaux anti coronavirus GET Une batterie d anticorps mono clonaux de souris specifiques du virus OET a ete preparee recemment 15 Un cer tain nombre d entre eux ant ete fournis par H Laude et utilises dans cette etude tableau I Anticorps polyclonal anti coronavlrus GET Le serum de la truie n 5215 qui a ete utilisee dans une etude anterieure 1 a servi a la preparation de l anticorps polyclonal Cette truie a ete vaccinee par voie orale avec la souche 188 S0 8 semaines avant la mise bas et la portee de porcelets a ete eprouvee au 4 e jour d age le serum recolte lors de I abattage deux semaines apres la mise bas presente un titre neutrali sant de 65 000 Preparation du conjugue Le marquage des anticorps al aide de la peroxidase a ete realise selon la technique de Nakane et Kawaoi 18 Detection des antlgenes structuraux du coronavirus de la GET L application de la technique ELISA sandwich 7 aux etudes virologiques et immunologiques de la GET a ete developpee recemment 2 La particularite de cette technique est la suivante 1 la sensibilisation des plaques plastiques Nunc Immunoplate II inter Med a ete faite seulement avec les anticorps monoclonaux anti virus GET 2 les conjugues revelateurs ont ete prepares avec des anticorps monoclonaux et polyclo naux Ie substrat est l eau oxygenee et Ie chrornogene est le 2 2 azino di acide 3 ethyl benzthiazoline sulphonique Boehringer la DO a 405 nm a ete mesuree avec un spectrophotometre Vernon 3 une reaction temoin est effectuee en parallele avec des globulines de souris non immunisees pour la sensibilisation des plaques dans les memes conditions et 4 les resultats sont exprimes par la difference entre les valeurs de densite optique des essais realises avec les anticorps monoclonaux et de ceux reali ses avec les immunoglobulines de souris non immunisees Traiternent du virus GET par Ie metaperlodate Le virus serni purifie par ultra centrifugation a ete traite par le metaperiodate adifferentes concentrations 0 7 mM pendant 1 h a 37 C Le traitement est arrete par l addition de glycerol concentra tion finale 10 070 TABLEAU 1 Caracterlstlques des anticorps anti coronavirus GET utilises au cours de la presente etude Titre Anticorps Specificite Designation Isotype neutralisant Monoclonal anti El 25 22 02a 20 anti E2 10 4 ND 6400 E2 20 9 02b 50 000 E2 25b21 02b 32 000 E2 51 13 02A 256 000 anti NP 22 6 02a 20 Polyclonal anti GET 52 15 65 000 TROIS SOUCHES DE CORONA VIR US DE LA GET 319 RESULTATS Conditions de la replication du virus en cycle unique en culture cellulaire 1 Cinetique d apparition des particules infectieuses Quel que soit Ie systeme cellulaire la souche 188 S0 se distingue des deux autres souches par un allongement de la phase de latence fig 1c et If En particulier dans les cellules RPD on observe un retard d environ 3 h De plus la production de la souche 188 S0 ne represente que 10 070 de celle des deux autres souches Cependant la phase exponentielle presente une pente similaire pour les trois souches Par rapport aux cellules RPD les cellules ST offrent au virus OET des meilleures conditions pour sa replication puisque celle ci est plus precoce et plus productive titres infectieux plus eleves 2 Cinetique de la synthese de I ARN et des proteines virales Presentes par la figure 1 a b d e les resultats sont les suivants Par rapport aux deux autres souches la souche 188 S0 est caracterisee par une incorporation plus faible d uridine tritiee En revanche la souche 188 S0 presente une incor poration plus importante de la leucine tritiee en particulier dans les cellules ST ce qui suggere un niveau de synthese de proteines plus elevee Enfin Ie systerne cellulaire a une influence importante on constate en effet que la synthese de I ARN viral dans les cellules ST est presque le double de celle qui est observee dans les cellules RPD Notons par ailleurs que la synthese de l ARN cellulaire est pratiquement negligeableen presence d 1 J g ml d acti nomycine D Analyse des antlgenes structuraux du virus GET produit a la fin du cycle 1 A partir des suspensions virales non puriflees des trois souches La reaction ELISA a ete realisee avec des anticorps monoclonaux Le materiel antigenique viral apparait plus abondant pour la souche 188 S0 que pour Ies deux autres souches Purdue 115 et D 52 fig 2 2 A partir des fractions d ultracentrifugation fig 3 Dans les frac tions qui contiennent les particules virales infectieuses correspondant a 39 40 de saccharose soit une DO de 1 17 1 18 les deux souches virales 188 S0 et Purdue 115 presentent des quantites similaires d ARN et de pro teines evaluees par la DO alors que Ie titre infectieux de la souche 188 S0 l05 8 PFU est inferieur de 90 070 a celui de la souche Purdue 115 10 6 8 PFU Dans des fractions pauvres en particules infectieuses mais riches en ARN correspondant a32 37 070 de saccharose soit une DO de 1 14 1 16 ou sedimentent habituellement les membranes cellulaires nos resultats reve lent une quantite dantigenes NP similaire pour les deux souches virales De plus dans les fractions contenant peu au pas d ARN correspondant it 27 32 de saccharose soit une DO de 1 11 1 14 l association des antigenes El et NP est presente en quantite importante pour la souche Purdue 115 la 320 T D NGUYEN ET COLL CeLLuLes 5T CeLLuLes RPD 20 u 1J lI C L a u J 10 1 c l X N 8 0 1J 0 J 0 C1l d f I a t A I oW o o d O Jri d u l i I D uo 1 6 2 7 3 4 5 o 8 24 32 J E a u J o OJ o J til J L I lI 0 lI c I 1J C 0 r L J I c l E a 16 u o 2 4 6 8 10 18 0 2 4 6 8 10 18 Temps heures FIG 1 Influ ence du systeme cellulaire sur les conditions de la replication du virus GET en cycle uniq ue en presence d actinomycine D l ug mt en fonction du temps Cellules ST a b et c cellules RPD d e et f Souches Purdue l1S D 52 et IBB SO O TROIS SOUCHES DE CORONA VIRUS DE LA GET 321 E2 r i j r 11 1 t f t j j f il t il l ii i NP E1 NP dcba 1 0 0 9 0 8 0 7 f E 0 6 r e III 0 0 5 m t f 0 Q 0 4 t x 0 3 i 0 2 r 0 1 i Iii 0 E1 FIG 2 Analyse quantitative comparee des antigenes structuraux du virus GET presents dans des suspensions virales recoltees 18 h p i des eel utes RPD et non purifiees Souches Purdue 115 raye D 52 pointille et 188 S0 blanc Les anti genes viraux sont detectes et titres par ELISA avec 7 anticorps monoclonaux sped fiques des proteines El 25 22 E2 a 53 31 b 20 9 c 25b 21 d 10 4 NP 22 6 et El plus NP souche D 52 presente de facon generale un comportement identique a celui de la souche Purdue 115 resultats non presentes En resume ces resultats mettent en evidence l abondance particuliere d antigenes structuraux synthe tises par la souche 188 S0 en culture cellulaire Influence de la tunicamycine sur Ie rendement en particules infectieuses L addition de la tunicamycine dans le milieu a pour effet de diminuer le rendement en virus infectieux fig 4 L effet inhibiteur de la tunicamycine est plus intense a la concentration de 1 ug ml pour la souche 188 S0 Par contre pour les autres souches on observe un effet inhibiteur proportionnel 322 T D NGUYEN ET COLL a la concentration de tunicamycine De plus on constate les faits suivants dans les cellules ST la multiplication virale de la souche 188 S0 est plus affectee par la tunicamycine que celie des autres souches inversement dans les cellules RPD la sensibilite ala tunicamycine est differente la souche 188 S0 est mains affectee que les deux autres souches virales a 01 o J 7 5 A 1 I 1 1 A 1 1 1 I I e I 1 1 IJ 1 1 A i l1 li1 r I jJ4 e i I io e I I A l o A A i J oot j6 DR 5 S eP 0 00J 5 1t Ii 1 I 1 f I A 1 f 1 I Al I 1 i E 0 1 I C A o o o a 0 2 z I a z 0 1 a T 0 4 E C 0 4 l I N J 0 0 o 1 234501234 Concentration de tunicamycine g mL 5 FIG 4 Influence de 0 tunicamycine sur 10 production des particules infectieuses du virus GET 18 h poi des cellules ST a et de cellules RPD b en cycle unique Souches Purdue 115 D 52 A et 188 S0 D Influence de la tunicamycine sur la synthese des antigenes structuraux La determination quantitative par ELISA des antigenes viraux contenus dans les suspensions virales demontre qu en presence de la tunicamycine la synthese globale des proteines virales diminue parallelement ala formation des particules infectieuses fig 5 Les resultats de la reaction ELISA met tant en oeuvre les anticorps monodonaux demontrent que la synthese non seulement des glycoproteines mais aussi de la nucleoproteine est affectee par l addition de la tunicamycine fig 6 Influence du traitement du virus seml purlfle par le metaperiodate sur son aetlvlte antlgenlque Cette experience a ete menee atitre de controle pour permettre de savoir si I alteration des parties glycosidiques des glycoproteines virales avait ou non une influence significativesur l activite antigenique du materielviral etudie dans ces conditions experimentales ELISA Pour cela nous avons choisi le metaperiodate dont les interactions sur les sucres sont connues 4 Le traite ment d une suspension virale souche Purdue 115 semi purifiee par ultracen trifugation n a pas d influence significative sur l expression de l activite antigenique en ELISA des glycoproteinesEl et E2 jusqu a la dose de 6 ug rnl 324 0 6 E C LrI 0 4 0 0 0 2 c T D NGUYEN ET COLL e i 0234501 2 3 450 1 234 5 Concentration de tunicamycine g ml FIG 5 Influence de la tunicamycine sur la production globale des antigenes structuraux EI E2 et NPdu virus GET 18 hp i descellules ST et descellulesRPD oJ en cycleunique Souches Purdue 115 D 52 et 18B Sa D Les antigenes structuraux sont titres par un test ELISA utilisant pour la sensibilisation des plaques un melange des differents anticorps monoclonaux specifiques de chacune des trois proteines virales et pour la revelation l anticorps polyclonal 5215 Au dela de cette dose 7 ug ml le metaperiodate affecte I antigenicite non seulement de deux glycoproteines E1 et E2 mais aussi de la nucleoproteine NP qui n est pas glycosylee fig 7 DISCUSSION La thermosensibilite de la replication a ete proposee dans le passe comme marqueur de la virulence du virus de la OET 9 11 Pourtant recemment a partir de huit souches du virus Laude et coll 14 ant montre que les conditions de la multiplication du virus en cycle unique en fonetion de la temperature ne pouvaient pas etre retenues comme rnarqueur Nos resultats indiquent que le rendement de virus est etroitement assode a Ia synthese de I ARN de chaque souche Les cinetiques de la synthese de l ARN et de la for mation des particules infectieuses sont en effet comparables Ainsi le faible taux de synthese de I ARN pourrait determiner indirectement 1 absence de virulence de Ia souche 188 S0 pour le poreelet nouveau ne 1 La faible synthese de I ARN viral dans les cellules RPD pourrait egalement expliquer les difficultes rencontrees pour preparer des stocks de virus de titre eleve dans ces cellules resultats non publies En revanche quel que soit le systeme cellulaire une synthese plus impor tante de proteines semble etre une caracteristique propre ala souche 188 S0 TROIS SOUCHES DE CORONA VIRUS DE LA GET 325 La difference de la synthese des proteines entre les deux types de cellules est determinee par celie propreaux cellules synthese endogene plutot que par l influence de la multiplication virale Quelle que soit la souche il est interes sant de noter que les conditions de synthese des proteines sont differentes de evelationpar le Polyclonal anti GET MonocLonal anti E Z Monoclonal anti NP 0 8 a oJ Itl ro Vl c 0 oJ U J J 0 C vr 0 c e QJ t Itl c C c C D a l J C D Itl C Vl 0 r u o 0 C r 0 CIl e c 41 en f t 41 b c a t z Itl c c c 0 C D e 0123 012 La suspension viraLe LogS d 0 4 0 6 0 2 E C In a s 0 0 8 0 0 6 0 4 0 2 FIG 6 Influence de la tunicamycine 0 5 lg ml sur la production des antigenes structu raux E2 et NP du virus GET souche Purdue I lS J8 h p i des cellules RPD en cycle unique Les antigenes structuraux E2 et NP presents dans les suspensions virales produites en presence et en l absence de tunicamycine sont titres par ELISA utilisant pour la sensibilite des plaques I anticorps monoclonal anti NP a b c et anti E2 d e I La revelation est realisee par les anticorps suivants polyclonal 5215 a c monoclonal anti E2 b c et monoclonal anti NP c I 326 T D NGUYEN ET COLL celle de I ARN Dans le cas de la souche 188 S0 le faible niveau observe dans la synthese d ARN et dans l apparition de particules infectieuses mais non dans la synthe