乙肝临床意义

时间分辨临床意义 乙肝 两对半 定量检测及临床应用 乙型肝炎的病因 HBV HBV颗粒 又称Dane颗粒 直径42nm抵抗力 耐受56 6小时及一般消毒剂 100 10分钟 或65 10小时可灭活 37 可保存 7天 20 可保存 15年 流行状况 在美国100 125万慢性患者大部分新感染者为20 39岁大约50 有急性症状大约5 000由于慢性肝炎死亡在中国HBsAg携带达10 高发地区13 2800万乙肝患者每年新发病人23 10万感染率50 80 南方高于北方全球3 5亿带菌者 几乎一半在中国 乙型肝炎的危害性 WHO估计2000年全球慢性HBV感染达4000万全球因乙肝死亡数100万 年慢性HBV感染是引起肝硬化和肝细胞癌的最主要原因肝癌 HCC 在HBV感染者的发病率是正常人群的1000倍 江苏启东 广西龙安 30 40 肝硬化病人的尸检是HCC 而90 HCC的发生在肝硬化的基础上我国每年有数以万计的人死于肝硬化和HCC 传播途径 血液传播药癖者感染医院性传播科室分布 消化 肝胆 普外和中医科 收容肝病多 口腔 化验 中心实验室 胃镜室 普外 接触机会多 感染机会高 血液 慢性肾衰病人 常需输血和透析 肿瘤病人 移植病人 免疫低下 针刺感染 受伤者HBsAb 10mIU ml 容易感染 传染血液HBeAg 感染率60 80 肾透析传播 对病人和医护人员同样高危母婴传播 垂直 围生和水平传播日常生活和性传播 传播途径的有效阻断 输血传播 采用更灵敏的试剂筛查母婴传播 主动 被动免疫 用更灵敏度的试剂筛查 用定量试剂评估和监测针刺意外处理 用更灵敏度的试剂筛查 用定量试剂评估和监测手术 血透和内窥镜检查病人的筛查 采用更灵敏的试剂筛查 乙型病毒性肝炎的诊断依据 流行病学资料临床症状体征实验室检查 常规生化和特异检查结果 HBV感染的确认 血清免疫学检测 HBV抗原抗体系统 乙肝两对半等 分子生物学检测 HBVDNA的检测 PCR法定量 斑点杂交法技术等 肝组织内HBV指标的检测 HBV血清指标 HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAbHBc IgM 乙肝表面抗原 HBsAg 第一个出现的血清指标持续或 6月为慢性感染高浓度表示高复制 100ng ml常同时伴HBeAg 低浓度的HBsAg可能是 在感染的恢复期 病毒低复制或不复制组织病变高度活动时 病毒和抗原已被部分清除可能是病毒变异HBsAg 仍有可能HBV感染 排除检测试剂灵敏度问题 可能是血清中含量的差异 乙肝表面抗体 HBsAb 当失去HBsAg后的恢复指标疫苗注射后的免疫性评价指标在HBV感染恢复期时 多克隆抗体做试剂时 出现HBsAg和HBsAb都为阴性的所谓 窗口期 单克隆抗体做试剂时 3 的病人出现HBsAg和HBsAb都为阳性单一低浓度的HBsAb可能是假阳性 用一步反应夹心法的试剂 单一单克隆抗体的使用会漏检 亚型或变异 乙肝核心抗体 HBcAb 表示现在或以前感染与恢复或免疫无必然联系由于HBcAg的高免疫原性 故HBcAb产生比HBsAb早且多 持续时间长 长达数十年 在我国正常人群中有10 的单一HBcAb 高浓度的HBcAb表示现行感染 常与HBsAg并存 主要是IgM 伴肝损伤 肝功能指标异常低浓度的HBcAb表示过去感染 常与HBsAb共存 主要是IgG 无肝损伤或已静息HBcAb含IgM IgA和IgG 在感染中依此出现和消失 IgG长期存在 乙肝核心抗体IgM HBcIgM 表示急性感染发病一周出现占90 也有1个月持续时间2 134周 14 超过1年高滴度是诊断急性乙肝的 标准 但需特殊标定 IgM 即使HBsAg 也可诊断急性肝炎IgM 即使HBsAg 却可能是慢性HBV感染重叠其它病原的急性病变暴发性乙型肝炎 可检出4 8倍的IgM浓度慢性乙型肝炎 肝细胞破坏 释放HBcAg产生免疫应答 可检出低水平IgM反应肝组织炎症 浓度与炎症程度相关反应病毒复制和干扰素治疗的监控 对 干扰素有效治疗的慢性乙肝病人 在Hbe血清转换前常有IgM滴度升高 后降至治疗前水平 乙肝e抗原 HBeAg 病毒复制相关 常与HBV DNA水平一致于急性慢性感染中存在缺乏的话 不代表病毒复制不存在在中国 30 的HBV感染者HBeAg 其中 80 自然阴转10 持续HBeAg 10 应病毒变异而阴性药物治疗的一个监测指标多个国际著名药厂肝炎治疗药物的评价 如Glaxo的拉米呋定 施贵宝的恩替卡韦 Roche公司的干扰素等 包括全国唯一一家CAP认证的实验室 美迪生 MDS 使用雅培的肝炎试剂进行药物临床评估 乙肝e抗体 HBeAb 当与HBeAg消失出现表示病毒复制渐趋静息HBe血清转换似为HBV感染过程的一个转折点但在慢性活动性肝病HBeAb 未必表示病毒不复制有些HBeAg消失后不出现HBeAb当与HBV DNA并存时可能表示前C区变异只有一种IgG抗体在HBV感染病人中 HBeAg和HBeAb同时阳性的有3 4 乙肝血清指标一般简图 不一致或不常见的血清指标模式 HBsAg阳性Anti HBc阴性HBsAg Anti HBs和Anti HBc阳性单一Anti HBc阳性HBsAg阴性 HBeAg阳性HBeAg和Anti Hbe同时阳性 单一HBsAg 急性HBV感染的早期 应随之出现HBeAg HBc IgM 如仍单独出现 需做确认在慢行HBV感染中 HBsAg和HBcAb共存占95 并常伴HBeAg或HBeAb 无HBe可出现在转换 窗期 或感染恢复期HBeAb已消失 HBsAg不伴HBcAb很少见 一旦出现为HBcAb缺失 单一HBsAb 注射HB疫苗或高价乙肝免疫球蛋白 HBIG 正常人群 非人工免疫 有5 10 的阳性率如浓度较低 注意非特异性反应一般为IgM抗体 无保护性 仍可再感染HBV HBsAg和HBsAb并存 少数感染恢复期可出现 常规试剂可能是非特异性反应在慢性HBV感染者中有3 5 二者共存 但并不表明HBsAg的清除或感染的恢复 可能是 前后感染二种HBV亚型 或HBsAg与抗体间低亲和反应S基因变异 HBsAg抗原性改变 原型HBsAb不能清除IFN 治疗出现HBsAb血清转换 因S基因变异 而未能清除HBsAgHB疫苗接种 有正常的HBsAb应答 HBsAg 而HBeAg 编码HBeAg的基因片段的短暂整合Source LauJNY etal JHepatol 1993 17 258 HBV感染 但HBcAb 抗原复合 高HBV复制 HBcAb被过量的HBcAg所掩蔽种族差异 我国7个民族的HBV感染 HBcAb缺失3 4 40 免疫缺陷 缺乏HBcAg特异的T细胞 体外无淋巴细胞增殖反应 单核细胞不能吞噬HBcAg颗粒 可能是抗原提呈细胞的缺陷HBsAg携带母亲出生的婴儿 由于母体的HBcAb的阻断 可无HBcAb的应答在免疫缺陷病人中出现肿瘤病人化疗所引起的免疫耐受病毒变异 前C区缺失和其它变异 单一的HBcAb 小孩 HBsAg 的母亲由于胎盘的屏障不能传递HBsAg给胎儿 但HBcAb可通过 出生后将逐渐消失成人 感染后恢复 急性感染后 窗期 主要是IgM抗体 随后出现HBsAb 但也可由于免疫应答较低未产生HBsAb 也可出现HBsAb后再消失低水平感染状态 单一HBcAb 活动性慢性肝炎病人 60 可检出HBV DNA 单一HBcAb 的 健康 人中 30 可检出病毒 这种无症状携带状态 可较长时间存在 注意数学后感染 相对浓度越高 HBV DNA的检出率越高 低相对浓度常预示过去感染 不常见模式的问题解释 用新波试剂有部分病例不符常见模式原因 试剂灵敏度提高病毒变异 亚型抗原复合物的形成主动或被动免疫的表现药物治疗的表现种族差异免疫缺陷或耐受对于这些情况 建议继续跟踪 75 85 急性发病血清转换图 慢性乙肝携带者后期 小三阳 慢性乙肝携带者无血清学转变 大三阳 乙肝表面抗原 消失 变异 什么是HBsAg消失变异 当感染乙肝病毒后 病毒在人体内复制当病毒复制时 变异会自然发生 在某些条件下 会加速其发生变异是改变了核酸序列 从而导致氨基酸序列的改变对于选择性压力下 乙肝HBsAg变异可能会出现在疫苗和治疗中如 HBIG治疗 野生型的HBV可能被中和 而变异株仍然存在 并具有活性 References Oon C J etal 1995 MolecularepidemiologyofHepatitisBvirusvaccinevariantsinSingapore Vaccine13 699 702 Coleman P F etal 1999 ImmunoassayDetectionofHepatitisBSurfaceAntigenMutants JournalofMedicalVirology59 19 24 Hunt C M etal 2000 ClinicalRelevanceofHepatitisBViralMutations Hepatology31 1037 1044 HBsAg消失变异在哪些情况下经常发生 至少有以下三种情况 1 在HBsAg阴性个体中仍有HBV存在2 对于母亲HBsAg阳性 新生儿疫苗接种失败3 对于正位肝移植 免疫预防剂失败 OLT Reference Locarnini S A 1998 HepatitisBVirusSurfaceAntigenandPolymeraseGeneVariants PotentialVirologicalandClinicalSignificance Hepatology27 294 297 orthotopic 哪些是最常发生的HBsAg变异 通常于免疫区段称 a 决定簇 aa124 147其中更容易变异的为接近于aa141 145 此部位是抗体必需结合的部位 最多的据报道是Gly 145 Arg抗原 抗体是免疫反应的核心 References Coleman P F etal 1999 ImmunoassayDetectionofHepatitisBSurfaceAntigenMutants J Med Virol 59 19 24 Ijaz S etal NovelImmunoassayfortheDetectionofHepatitisBSurface Escape MutantsandItsApplicationinLiverTransplantRecipients J Med Virol 63 210 216 为什么HBsAg变异重要 Kalininaetal 第一个报道 HBVS于暴肝中分离的变异导致严重的病毒分泌缺陷 此现象造成细胞迅速死亡 而肝衰竭 Gly145Arg为其中的一个变异造成暴肝 Kalinina etal 2001 ADominantHepatitisBVirusPopulationDefectiveinVirusSecretionBecauseofSeveralS GeneMutationsfromaPatientWithFulminantHepatitis Hepatology34 385 394 为什么HBsAg变异重要 影响乙肝防疫 疫苗 流行 血站 医院筛查 和诊断假阴性结果将会产生不必要的复杂性或延误诊断 漏检HBsAg部分后果 90 感染HBV的新生儿将成为慢性携带者 根据美国CDC的统计此人群中的死亡率为15 25 见CDCwebsitehttp www cdc gov 美国CDC估计美国22 000HBV阳性的母亲将产子 有变异情况的约1 0 4 6 所以在美国此人群中 每年有220 1012人发生变异 未经统计的其他人群的漏检 长期慢性乙肝病人的病毒突变经历多种治疗方案的乙肝病人 治疗压力病毒复杂共感染人群免疫系统疾病的乙肝人群其他 移植等 低水平HBsAg测定的重要性 国内低水平HBsAg病人的分布情况 正常人群中低水平的HBsAg 5ng ml 为2 3 在HBsAg 人群中占23 24 其中 1ng ml占45 左右 在低水平HBsAg样品中 提高检测灵敏度的重要性 中国肝炎人口多 基数大造成确诊的困难医院内的感染输血传播母婴传播的阻断 HBsAb定量在疫苗评估中的推荐 GermanPermanentVaccinationCommission STIKO 国内疫苗评价标准 无应答者 无抗体产生 5 人群百分比 加强计量复种低应答者 100mIU ml 20 人群百分比 无须复种 德国STIKO疫苗评价推荐 无应答者 无抗体产生 复种并随访Anti HBs低应答者 100mIU ml 10年后复种 血清乙肝标志物 两对半 定性测定始于80年代中期 对乙肝的疾病诊断 病程监测 疗效观察起到了一定的作用 肝炎的恢复是一个动态过程 用阳性或阴性来判定结果会给临床带来许多困惑 随着临床医学的迅速发展 定性检测已远远不能满足临床及患者的要求 由于受检测抗原抗体 定性 结果不是 阴性 就是 阳性 只能作程序式的 机械的判断 对某些结果不能作出合理解释 存在较大的缺陷 无法动态观察病情和疗效变化 为临床所能提供的信息有限 随着医学检验中新型标记方法的建立 时间分辨荧光免疫分析技术 使得 两对半 定量测定成为可行 大大弥补了酶标 ELISA 定性检测的不足之处 乙肝 两对半 检测历史 提高了检测的灵敏度 时间分辨荧光免疫技术 TRF 检测HbsAg灵敏度可达0 2ng ml 而酶标 ELISA 检测HbsAg灵敏度是1ng ml 也就是说只有血清中的HbsAg达到1ng ml酶标才会呈阳性 急性乙肝早期诊断 急性乙肝早期 TRF定量能及早检出HbsAg 确证HBV感染 几乎能与preS1同时检测 在病程观察中大大缩短 窗口期 时间 而酶标在乙肝早期检测往往HbsAg呈阴性 慢性乙肝 一些患者由于机体对HBV包膜蛋白 HbsAg 表达较低 酶标检测可出现HbsAg和抗 Hbs均阴性的情况 而TRF技术则可避免这些情况的出现 为正确判断病情提供依据 变异病毒的检测 病毒发生变异后 表达量较低 常规ELISA测不出抗原 而TRF定量具有极高的灵敏度 可发现并极有可能同时检测出HbsAg和抗 Hbs 血清中HbsAg含量和病人对HbsAg细胞免疫成反比关系 而肝功能改变则与此种细胞免疫成正比 定量HbsAg是反映这一关系的唯一手段 一些群体如医护工作者 病人家属等 由于长期密切接触 但又非直接经血传播感染成急性乙肝 而是长期少量感染 并刺激机体产生一定的免疫力 可能呈低浓度感染 特别应当引起人们的足够重视 密切关注并采取措施防止发展成乙肝或慢性携带者 发现低浓度HbsAg携带者 以动态观察疗效和病情监测 疾病的发生 发展 疗效 预后是一个动态的变化的过程 TRF定量检测乙肝 两对半 各项标志物的浓度变化可对乙肝的病程 治疗 预后起一个全程动态检测的作用 能够为医生对病情疗效作出合理的解释提供依据 指导治疗 HbsAg和抗 Hbs的动态变化 定量分析HbsAg和抗 Hbs的浓度变化 可以预见急性乙肝是否处于恢复期 如HbsAg浓度降低 抗 Hbs的浓度逐渐升高 可说明病情正往恢复期发展 反之 HbsAg浓度处于较高水平或上升趋势 而抗 Hbs一直处于较底水平 则容易发展为慢性乙肝或携带者 HbeAg和抗 Hbe的动态变化 定量分析HbeAg和抗 Hbe的浓度变化 可以反映病情变化和治疗效果 定量测定能明确检测HbeAg向抗 Hbe转换的时期 即表现为HbeAg浓度 NCU 下降和抗 Hbe浓度 NCU 升高的过程 高浓度的HbeAg还可间接提示病毒处于高复制状态 具有较高的传染性 高浓度的抗 Hbe一方面提示病情的好转 而在某些时候 如肝功能指标很差 可能与肝坏死 肝硬化 肝癌有关 抗 Hbc指标的变化 抗 Hbc浓度的高低可以反映病毒感染的状态 高浓度的抗 Hbc提示乙肝急性感染 恢复期浓度降低 慢性乙肝呈抗 Hbc持续高浓度 而低浓度的抗 Hbc一般为恢复期或既往感染 有利于对慢性肝炎活动性和非活动性的判断 非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定 活动性往往呈进行性变化 一步法 固相载体 样品和标记物同时一起孵育 并在最后检测前只有一步冲洗 这对较多干扰物质的疾病 如 肝炎 甲状腺激素和肿瘤标志物 容易产生干扰而使分析的灵敏度和特异性都受到影响二步法 二个冲洗步骤 一次在固相载体和样品孵育之后 第二次在加入标记物孵育之后 可以确保好的结果 如 消除非特异性蛋白结合 内源性的干扰物质和HOOK效应 关于一步法和二步法 两步冲洗法 可避免此效应 高浓度样品 高浓度的结合物 前带 后带效应的机制 固相载体 一步法和两步法比较 一步法优点 相同的其他因素时 一步法可增加灵敏度可降低成本 包括 劳动力和时间 自动化仪器缺点 夹心法有HOOK效应 10000ng ml 非特异性反应其他样本质素的干扰 两步法优点 特异性较好无HOOK效应结果稳定 精密度较好仍具有相当的灵敏度 其它因素有提高空间 缺点 成本相对略高一般操作时间延长 HbeAg阳性慢性肝炎 由于HBV野生型感染引起 其自然史分HbeAg阳性期和抗 Hbe阳性期 定量测定能明确检测HbeAg向抗 Hbe转化的时期 即表现为HbeAg浓度 NCU 的下降和抗 Hbe NCU 浓度 NCU 升高的过程 抗 Hbe阳性慢性肝炎 主要由前C基因突变株HBV感染所致 也称异型慢性肝炎 始终不出现HbeAg 但HBV DNA进行复制 HbsAg亦在高浓度处变动 与前者HbeAg阳性慢性肝炎中的转化期比较 两对半 定性均表现为小三阳 但后者主要表现在高HbsAg浓度 忽高忽低的ALT值和HBV DNA始终阳性 这类病人往往对干扰素 拉米呋啶治疗效果不佳 慢性乙肝的分类 结合PCR诊断病情 血清HBV DNA荧光定量PCR测定可以直接反映病毒复制状态 具有很多临床应用价值 但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态 HBV DNA阴性并不完全代表体内HBV已被清除 结合 两对半 各项指标更能客观反映体内HBV病毒状态 正确判断预后和治疗 如果HBV DNA阴性而HbsAg HbeAg或抗 Hbe及抗 Hbc浓度均还较高 提示并未完全痊愈 有可能病毒再次出现复制状况 尚须密切关注 如果HBV DNA阴性而HbsAg HbeAg或抗 Hbe及抗 Hbc浓度均很低或阴性并持续一段时间 提示可能完全痊愈 预后疗效良好 抗 Hbs的含量在10mIU mI以上病人在用ELISA检测就可呈抗 Hbs 阳性 结果 但并不提示机体都一定具有免疫力 而抗 Hbs的含量在10 100mIU mI之间的样本 定性虽为 阳性 但此时机体对HBV的免疫力较弱 甚至不能预防HBV感染 仍有感染HBV的危险 只有抗 Hbs的含量达到100mIU mI以上时才可确定具有抵抗HBV入侵的作用 因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义 特别是在少年儿童预防乙肝方面 对乙肝的预防起到监督作用 结束语 在慢性肝病的治疗过程中 病人对了解自己病情的变化最为关切 定量测定乙肝血清标志物的浓度使病人能够对自己的病情有更清楚的了解 提高治疗信心 同时也加强对医生的信任度 有助于改善医患关系 利于疾病治疗