基因定位与克隆

胡正茂 huzhengmao 基因定位与克隆 基因定位或基因制图 genemapping 人类的基因定位或基因制图 genemapping 是近年来发展最快的领域之一 它的目的在于决定不同的基因在染色体上的位置 一条染色体是一条独立的DNA链 同一条染色体上的基因在该染色体上呈线性排列 人类的20000 25000个基因分布在24种染色体上 它们在染色体上的位置可通过两种制图方法来表示 1 物理图谱 physicalmap 即确定基因之间的绝对物理学距离 通常用Mb 百万碱基对 或Kb 千碱基对 来表示2 遗传图谱 geneticmap 即确定基因之间的遗传学距离 用cM centimorgen分摩 表示 广泛定义 基因克隆 基因克隆通常涉及到将构成某一基因的基因组DNA genomicDNA gDNA 或互补DNA complemantaryDNA cDNA 插入某一载体内 利用载体在宿主细胞 通常用大肠杆菌 中大量繁殖而获得该基因的足够量的拷贝 以便于进行基因的结构和功能的分析 广义的基因克隆也包括任何使基因或DNA片段扩增的操作 医学遗传学讨论的基因定位与克隆实质上不是广泛意义上的基因定位与克隆 主要针对致病基因的鉴定 即将某一特定基因的突变与某一特定的疾病联系起来 确定基因突变与某一疾病之间的因果关系 了解其致病机理 为疾病的诊断 预防和治疗提供理论依据 基因定位方法strategyforgenemapping 染色体多态法 chromosomeheteromorphism 染色体畸变法 chromosomeabnormality 体细胞杂种法 somaticcellhybrids 染色体分类法 chromosomesorting 原位杂交法 FISH 剂量分析法 dosageananlysis 测序法 sequencing 家系分析法 pedigreeananlysis 染色体多态法 主要限于性染色体上的定位 根据某些性状或疾病在男女性别间的差异 结合系谱分析 将这些基因定位在X染色体上 Duffy血型基因定位于1号染色体上 Donahue在做染色体实验时发现自己的1号染色体长臂在靠近着丝粒区的地方变长了 通过对他自己家族成员染色体的观察发现 这一异常是遗传的 将其作为1号染色体上的一个特定的标记 随后发现这一标记与Duffy血型具有平行性 表明这种染色体的异常结构同这一基因相连锁 因此将此血型基因定位于1号染色体上 染色体畸变法畸变常涉及两个位点 如果这两个位点之一正好是某一功能基因所在的位置 染色体的畸变则肯破坏该基因的正常功能而引起疾病 根据染色体畸变的位置和疾病发生的关系 则可将致病基因定位于染色体的某一特定位置上 NLMG 染色体异常进行基因定位 睾丸决定因子Testisdeterminingfactor 体细胞杂种法体细胞杂种通常由人和鼠的体细胞融合而成 这些融合细胞在最初几代培养过程中具有选择性丢失人类染色体趋势 而保留所有的鼠染色体 保留在融合细胞中的染色体可以是多条 也可能只有一条甚至某条染色体的一部分 根据研究的需要可将含有不同人类染色体的人鼠杂种细胞组合成人鼠杂种细胞板 hybridpanel 结合杂种细胞板和PCR的方法或基因剂量分析 或蛋白质表达分析 可将相应的基因定位到特定的染色体或染色体片段上 该杂种细胞板在人类基因定位以及人类基因组计划中发挥过重要的作用 体细胞杂交基因定位示意图 Miller等运用体细胞杂交证明胸苷激酶 TK 位于人的17号染色体 这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位 原位杂交法 FISH 如果一个基因或基因的某一部分已经被克隆 则可将该基因用同位素或荧光标记和染色体原位的分子杂交 在染色体上恒定出现信号的区域即该基因在染色体上的位置 同一染色体上的多个不同的基因可用不同的荧光标记来鉴别他们在染色体上的相对位置 运用这一方法在中期染色体上 可区分两个相隔约2Mb的基因 在间期染色体上 据称可鉴别仅相隔50kb的两个基因 CONNEXIN31 1 候选克隆 根据基因的功能 结构及已有的研究发现 预测可能与目的新基因有关的疾病 然后在相应患者中检测该基因的突变情况 位置克隆 目前最常用的方法 将某一疾病的致病基因用连锁分析的方法定位在某一染色体的特定位置上或区域内 然后在该位置上或区域内鉴定其致病基因 连锁分析原理 生殖细胞在减数分裂时发生交换 一对同源染色体上存在着两两相邻的基因座位 若两者之间距离较远 发生交换的机会较多 则出现重组次数就多 若两者之间距离较近 则重组机会较少 连锁分析就是根据基因在染色体上呈线性排列 不同基因相互连锁成连锁群的原理 即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位 1 2 3 基因分型 Genotyping 除性染色体外 每个人体内的染色体都有两份 一个人所拥有的一对等位位点的类型被称作基因型genotype 对SNP位点而言 一个人有三种可能性 分别是AA AG或GG 这种基因型的差异叫做单核苷酸多态性 SNP 通过实验确定某个个体在某个多态性位点的基因型 被称作基因分型 几种多态标记 1 RFLPs 2 STRPs 3 SNPs 第一代标记 RFLP restrictionfragmentlengthpolymorphism 限制性内切酶可在特定的核苷酸位置切割DNA DNA序列的改变甚至是一个碱基的改变 都可能改变限制性内切酶酶切片段的长度 通过凝胶电泳可以方便地检测这种长度的 多态性 RFLP在整个基因组中都存在 根据对RFLP片段的多态性分析 可对某些疾病进行诊断并将与疾病有关的基因进行定位 http www ncbi nlm nih gov projects genome probe doc TechRFLP shtml 1980年 Botstein首次提出 使用特殊的外切酶切断DNA中特殊位点1987年 第一张较完整的人基因连锁图 包含393个RFLP位点 缺点 数目少 信息量小 成本昂贵 操作繁琐 不易发展到自动化水平 第二代标记 STR shorttandemrepeatpolymorphism 例如基因组中两个或两个以上的核苷酸短串联重复序列 CA n 微卫星标记等 在不同个体中重复单位的数目变异非常大 微卫星标记荧光电泳图 STR广泛存在于人基因组 占约5 基本单位是2bp 6bp的串联重复 其中以 CA n GT n常见 1996年建立了以6000多个STR为主体的遗传图谱 目前有10000个左右的位点 主要用于个体识别优点 信息量大 易实现自动化 缺点 标记数量不够多 随着人类基因组计划 国际人类基因组单体型计划 Hapmap计划 的完成 大量的SNP被发现 利用先进的高通量基因芯片技术 精确揭示重大疾病的基因变异 从而阐明疾病的遗传学发病机制 是目前科学界公认的最为有效的搜寻重大疾病易感基因的研究方法 被Science杂志评为2007年十大科学进展之首 迄今已发现的SNP约900 1 000万个 相关的文章约4000余篇 特点 数量丰富双等位标记 简单的 分析根据结果可以估算出某个等位基因在一个群体中的频率易于实现自动化 快速筛查 SNP作为遗传标记的优势 家系分析法 Lods 在家系中 重组率是进行连锁分析的基础 Lodscore结果判定 Lod 3肯定连锁 Lod 2否定连锁 2 Lod 1则还需增加样本资料 2010年在国内最早应用外显子组测序技术克隆了一个新的共济失调致病基因TGM6 2004年定位与克隆角膜环状皮样瘤基因 角膜环状皮样瘤是一种先天性角膜良性肿瘤 呈常染色体显性遗传 以双侧眼球角膜缘处环形淡黄色肿块为特征 可延伸到结膜 患者可出现视力的改变如弱视 斜视和散光 皮样瘤由外胚层包括角化的上皮 毛发 皮脂腺和中胚层包括纤维组织 脂肪组织 血管组成 角膜环状皮样瘤家系图 基因组扫描的流程 DNA抽提 利用STR引物多重PCR Genotype基因分型 Linkage连锁分析 侯选基因 突变检测 定位基因 多重PCR 使用PE公司一套覆盖基因组22条常染色体 高杂合度的微卫星位点引物 一共382对 采用Touchdown程序结合多重PCR反应方法 将5 12种不同引物混合 放入同一管中进行扩增 总反应体积5 l 以上结果说明这个单体型在该家系中与疾病共分离 而这些重组事件的发生则将角膜环状皮样瘤疾病基因定位于4q24 26的D4S1572和D4S1522之间15 2cM范围内 侯选基因的筛选 首先进行UCSC数据库 April 2003 查询D4S1572 D4S1522之间15 2cM的基因资料 结果显示在这个区间总计有65个knowngenes 52个Referencegenes进行候选基因筛选时 考虑到组织发生中皮样瘤为异位到角膜的正常组织 推测角膜环状皮样瘤致病基因可能与胚层的移行 细胞的发育和分化密切相关 侯选基因的筛选 通过筛选 选取其中3个能与组织细胞的发育分化和移行有关并在眼睛表达的基因 CXXC4PITX2TM4SF9 PITX2 是一个转录调控因子 与发育相关 有重要的功能 神经性耳聋疾病基因GJB3的克隆 GJB3基因的计算机克隆 3 RACE或者nested PCR共获得cDNA片段1059bp 其中ORF813bp 编码的氨基酸270aa个 该ORF与小鼠Gjb3在813bp的一致性为83 4 与大鼠Gjb3在813bp的一致性为84 6 推测的氨基酸与小鼠Gjb3在270aa的一致性为82 6 与大鼠Gjb3在270aa的一致性为83 蛋白质的结构 4个跨膜区2个胞外区3个胞内区 1of5 Humancx31comparetootherGJBprotein GJB3 connexin31 wasmappedto1p33 35byFISH 定位在1p33 p35的疾病有常染色体显性遗传的感觉神经性耳聋 DFNA2 CMT2A型的腓骨肌萎缩症 变异性红皮病和眼睑下垂 我们在中国遗传病家系收集数据库收集的神经性耳聋和腓骨肌萎缩症的病人中检测突变 在两个高频听力减退的浙江家系和湖南家系中分别发现错义和无义突变的杂合子 并选择了非相关的150名个体进行检测 未检测到错义和无义突变 同胞对连锁分析 如果两个血缘相关个体表型类似 那么与此性状相关的基因附近的遗传标记也应当类似 类似程度受多个因素的影响 关联研究常见类型 1 病例 对照研究 收集一组患者以及一组匹配的对照 比较侯选位点等位基因频率是否存在显著性差异病例对照研究不需要确认家庭单位 容易收集研究对象 但是其缺点是疾病和位点间的等位基因关联可能因为人群混合产生 而不是由于遗传标记和染色体上导致性状的突变位点接近 因此选择对照就很必要 APOE 4 A为实际观察值T为理论期望值 2 传递不平衡检测 TDT 应用家系内对照比较传递与未传递给受累子代的等位基因频率有无差异TDT有效利用未传递的等位基因作为对照 对照和疾病基因由同一个体提供 分层就被降低或者消除了 TDT应用前提及特点 前提 杂合子父母在研究位点有一个关联的等位基因和非关联的等位基因 关联的等位基因以非随机的高概率传递给受累的子代 特点 1 仅仅需要 父母 子 三联体 家系容易收集2 比受累同胞对检验连锁的效能要强3 对人群分层不敏感4 不存在关联的前提下 无法检测连锁 常用计算机分析软件 LINKAGEMERLINGENEHUNTERHAPLOVIEWSIMWALK2 我们的研究思路 孤独症样本 染色体研究CNV分析大规模GWASCandidateGenes 患者M8560染色体3的CNV 影响CNTN4基因 P