王清洪低氧模拟剂氯化钴.ppt

低氧模拟剂氯化钴对胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达的影响 王清洪制作学号 092406102 摘要 S100A4基因是肿瘤侵袭转移相关的重要基因 该基因高表达与胃癌浸润 淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关 为探讨S100A4基因高表达的机制 用低氧模拟剂氯化钴处理胃癌细胞BGC823 RT PCR 免疫组化 免疫荧光及Westernblotting方法分别检测BGC823细胞中S100A4mRNA及蛋白表达情况 结果显示 氯化钴处理胃癌BGC823细胞后 S100A4mRNA及蛋白表达明显增加 提示低氧模拟剂氯化钴可促进胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达 低氧是实体肿瘤的共同特征 它是癌细胞快速增殖与血液供应相对滞后的结果 低氧引起肿瘤细胞生物学特性发生改变 如细胞侵袭 转移能力增加 并可能对放化疗产生耐受 低氧对细胞的影响主要通过调节基因表达而实现 因此研究低氧环境下转移相关基因的表达变化具有重要意义 S100A4蛋白是钙离子结合蛋白S100家族的成员之一 可降低肿瘤细胞间黏附能力 促进细胞外基质水解和重塑 增强肿瘤细胞运动能力 促进血管生成等 在肿瘤侵袭转移过程中发挥关键性作用 现已证实S100A4高表达与胃癌浸润 淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关 但是目前关于S100A4表达调控的研究报道甚少 低氧是否可调节S100A4表达 尚未见报道 我们应用生物信息学软件在S100A4基因的调控区预测到低氧反应元件 推测微环境低氧可能上调S100A4基因表达 因此本实验观察了低氧模拟剂氯化钴处理对人胃癌细胞系BGC823中S100A4表达的影响 旨在研究微环境低氧对胃癌侵袭转移影响的机制 并探讨S100A4基因表达调控的新途径 材料和方法 主要材料 BGC823细胞系 RPMI1640培养基 胎牛血清 氯化钴 兔抗人S100A4多克隆抗体 b actin抗体 总RNA提取试剂Trizol 反转录试剂盒及PCR扩增试剂盒 PCR引物 细胞培养和低氧诱导 取低分化的人胃腺癌细胞系BGC823 用含10 胎牛血清的RPMI1640培养液 另加青霉素 100U mL 和链霉素 100mg mL 37 5 CO2及饱和湿度的条件下培养 细胞生长至60 70 融合度后 实验组加入含低氧模拟剂氯化钴 终浓度为100 500mmol L 的培养基 对照组为正常培养基 继续培养24h后收集细胞 方法 RT PCR检测BGC823细胞中S100A4mRNA表达 收集实验组和对照组细胞 应用Trizol提取总RNA 采用逆转录试剂盒将mRNA逆转录合成cDNA 取反转录产物2mL进行PCR反应 S100A4引物序列 上游 5 GATGTGATGGTGTCCACCTT 3 下游 5 ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA 3 扩增片段长度为277bp 复性温度为58 内参照b actin引物序列 上游 5 CCAGATCAtGTTTGAGACCT 3 下游 5 TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT 3 扩增片段长度为480bp 复性温度为58 循环条件 95 预变性5min 94 变性30s 58 复性30s 72 延伸30s 30个循环 72 延伸10min PCR产物用1 2 琼脂糖凝胶电泳 LabWORKS凝胶图像分析系统分析扩增产物条带的光密度值 并通过S100A4光密度值与b actin光密度值的比值反映S100A4mRNA表达量的高低 Westernblotting检测BGC823细胞中S100A4蛋白表达 收集实验组和对照组细胞 立即置于冰上 吸净培养基并以4 预冷的PBS漂洗细胞1 2次 提取细胞总蛋白 以Bradford法作蛋白定量后 取50mg蛋白作SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 5 积层胶 10 分离胶 电转膜后 加入兔抗人S100A4多克隆抗体 1 1000 和羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体 b actin作为内参照 利用ECL显色试剂盒显色 应用图象分析仪测定条带光密度值 以S100A4光密度值与b actin光密度值的比值来反映S100A4蛋白表达的高低 免疫细胞化学及免疫荧光检测S100A4蛋白在BGC823细胞中的表达 将BGC823细胞接种于玻片上 200mmol L氯化钴处理24h后 取出玻片 4 甲醛固定 一抗为兔抗人S100A4多克隆抗体 1 1000稀释 4 孵育过夜 免疫组化采用北京中杉金桥生物技术有限公司SP检测试剂盒进行 DAB显色 光学显微镜下观察结果 免疫荧光二抗为FITC标记的鼠抗兔IgG 1 2000稀释 室温孵育2h后荧光显微镜下观察结果 统计学分析 采用SPSS统计软件进行检验 P 0 05具有统计学意义 结果与分析 氯化钴对BGC823细胞S100A4mRNA表达的影响氯化钴对BGC823细胞S100A4蛋白表达的影响免疫组化和免疫荧光检测S100A4在BGC823细胞中的表达 RT PCR结果显示 不同浓度氯化钴处理24h后 BGC823细胞中S100A4mRNA表达改变如下 100mmol L 500mmol L氯化钴处理后 S100A4mRNA表达无明显变化 200mmol L氯化钴处理后S100A4mRNA表达明显升高 采用200mmol L氯化钴处理细胞重复实验3次 结果显示实验组mRNA表达 1 5567 0 2676 显著高于对照组 0 8267 0 1850 P 0 05 可见200mmol L氯化钴处理可以使S100A4mRNA表达显著增高 氯化钴对BGC823细胞S100A4mRNA表达的影响 氯化钴对BGC823细胞S100A4蛋白表达的影响 Westernblotting结果显示 200mmol LCoCl2处理24h后 S100A4蛋白表达明显增高 实验组S100A4蛋白表达 1 6633 0 3496 显著高于对照组 0 7300 0 1868 P 0 05 免疫组化和免疫荧光检测S100A4在BGC823细胞中的表达 免疫组化及免疫荧光结果显示 氯化钴处理后S100A4蛋白表达明显高于对照组 讨论 近年来微环境低氧与肿瘤的关系倍受关注 低氧通过调控多种基因表达而影响肿瘤细胞的生物学特性 为探讨低氧对胃癌细胞中S100A4表达是否具有调控作用 本实验首先应用不同浓度低氧模拟剂氯化钴对胃癌BGC823细胞进行体外模拟低氧处理 RT PCR结果显示 氯化钴处理后S100A4蛋白表达较对照组明显增高 表明微环境低氧可使胃癌细胞S100A4基因表达增高 而S100A4作为一种重要转移相关基因 其高表达可使胃癌细胞生物学特性发生变化 如侵袭转移等能力增加 因而促进胃癌的进展 可见S100A4是低氧对胃癌细胞影响的一个重要介导者 本研究首次证明低氧模拟剂氯化钴处理可以使胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达增高 该结果加深了低氧对胃癌侵袭转移影响分子机制的认识 同时也发现了S100A4基因表达调控的新途径 微环境低氧 该结果为胃癌侵袭转移的防治研究提供了重要科学依据 也为其他肿瘤的研究提供了新思路 参考文献 1 GrahamCH ForsdikeJ FitzgeraldCJ Macdonald GoodfellowS Hypoxia mediatedstimulationofcarcinomacellinvasivenessviaupregulationofurokinasereceptorexpression IntJCancer 1999 80 4 617 623 2 MazzuccheliL ProteinS100A4 toolongoverlookedbypathologists AmJPathol 2002 160 1 7 13 3 JenkinsonSR BarracloughR WestCR RudlandPS S100A4regulatescellmotilityandinvasioninaninvitromodelforbreastcancermetastasis BrJCancer 2004 90 1 253 262 4 XueC PliethD VenkovC XuC NeilsonEG Thegatekeepereffectofepithelial mesenchymaltransitionregulatesthefrequencyofbreastcancermetastasis CancerRes 2003 63 12 3386 3394 5 GrigorianM AndresenS TulchinskynE KriajevskaM CarlbergC KruseC CohnM AmbartsumianN CAnnette SelivanovaG LukanidinE Tumorsuppressorp53proteinisanewtargetforthemetastasis associatedMts1 S100A4protein functionalconsequencesoftheirinteraction JBiolChem 2001 276 25 22699 22708 6 KeirsebilckA BonneS BruyneelE VermassenP LukanidinE MareelM vanRovF E cadherinandmetastasis mts 1 S100A4 expressionlevelsareinverselyregulatedintwotumourcellfamilies CancerRes 1998 58 20 4587 4791 7 滑君 付浩 张瑞秀 陈丹琦 闫扬 陈芳杰 孙开来 孙秀菊 遗传2008Vol 30 12 1563 1566 谢谢大家 王清洪