蛋白提取实验步骤.doc

蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA（在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。注意事项1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80冰箱，并避免反复冻融。2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200l）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20保存，避免反复冻融。