RNAi、miRNA及siRNA的区别和联系.doc

用siRNA进行transient transfection不稳定，几代细胞以后，症状就会消失，所以在转染几天（）后要立刻抽提蛋白，进行分析用质粒中的shRNA进行转染，如果质粒含有抗生素位点，可以进行筛选，获得较稳定的细胞株系，但需要时间较长用病毒中的shRNA进行感染（infection），抗生素筛选后，可以获得很稳定细胞株系瞬时RNAi 短时转染是一种常见的简单生物手段，这种手段能够将外源性的siRNA或是能够编码siRNA的质粒通过非病毒感染的方式导入细胞中。转染的细胞通常在细胞质膜表面有一个短时小孔或者一个“洞”，这些特殊的孔结够能够让基因物质通过细胞膜进入细胞质中。转染过程中可以借助磷酸钙与形成极小的磷酸钙复合物沉淀黏附在细胞膜表面，而借助内吞作用加速基因物质进入细胞质。或者也可以通过借助带正电荷的阳离子脂质体形成脂质体包含物体，然后经过内吞作用进入细胞质中。.不过上述的这些转染技术所产生的沉默作用持续时间较短，因为所诱导的siRNA不能够进行自身复制而且会因为细胞的分化而被稀释或降解。转染的外源DNA由于不能够插入核内基因组通常会在细胞经历有丝分裂过程中丢失。一旦所转染的细胞中siRNA消失后，靶基因功能又重新恢复到转染前水平。采用转染技术来产生基因沉默通常要在小时才能达到高沉默率，而且根据不同转染效率也只能维持小时。因此，siRNA转染可作为短期分析基因功能的有效工具，而且可以方便快速去验证针对靶基因所设的siRNA干扰效率。当前，由于siRNA转染技术易于制备、随时可用以及很短的操作时间等特点主要用于短时基因沉默。长久RNAi由于表型改变通常和基因型改变在时间上不同步，许多分析试验就要求长时间对靶基因的沉默。siRNA转染直接产生的沉默由于其短时性就不能用于长时间的实验研究，人工合成siRNA的转染手段由于其不稳定性和低转染效率不能广泛运用于其他类型细胞。使用载体质粒手段也同样受细胞系限制，比如原代细胞就不能转染其用做长期培养研究。长时期的基因沉默就特别需要发展一类长期稳定的细胞系，这就要求所转染的外源基因能够长期留在宿主细胞基因组中或者其子代细胞细基因组中.。病毒介导siRNA载体其病毒高感染效率特点对于原代细胞和其它难转染细胞是一种很好的选择。为了准确地测定siRNA对细胞靶基因的沉默效率，就必须能够转染更多的细胞。否则，如果转染细胞的数量不够的时候，那么在使用RT-PCR或Western analysis进行分析的时候，背景条件中的非转染细胞就会干扰我们对转染细胞的分析结果。目前，有下面几种表达传递发卡siRNA病毒载体，包括：1.逆转录病毒载体, 这是一种比较好用的载体，它能够将siRNA表达框整合到分化的细胞基因组中并能够通过在抗生素选择条件下维持稳定长期的hsRNA表达。2.慢病毒载体，这种载体扩大了宿主细胞的种类包括一些未分化的细胞和分化末期细胞，通过扩增，转导成功的细胞基因组中将会永远包含shRNA表达框，并能够稳定表达shRNA，产生持久的基因沉默的效果。3. 腺病毒载体，这也是一种常见的分整合病毒，它能够感染分化和未分化的细胞，但只能在细胞中以一种游离体的形式存在。 优点 缺点短暂转染 方便快捷 不可再生，短期稳定转染 稳定性，永久性 滞后性，致死性 可诱导RNA干扰 可逆调控 耗时RNAi、miRNA及siRNA的区别和联系RNA干扰 （RNAi）：近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。MicroRNA（miRNA,微RNA）：即为长度为22nt左右的5端带磷酸基团、3端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。小干涉RNA（siRNA）：是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。miRNA与siRNA之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在22nt左右。2.二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。3.二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。4.二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。5.miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。miRNA与siRNA的不同点：1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。6.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。