聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白.doc

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白实验目的(1)学习聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳原理。(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。(3)比较醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白的操作效果。实验原理带电质点在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。实验试剂1、待测样品：新鲜血清2、制备分离胶、浓缩胶有关试剂：(1)凝胶缓冲液：称取1 mol/L HCl 48ml,Tris(三羟基氨基甲烷)36.6g,TEMED 0.23mL,加重蒸馏水至80mL 使其溶解，调pH8.9，然后加重蒸馏水定容至100mL ，至棕色瓶，冰箱储藏。(2)分离胶贮液，一般有两种配法：28Acr-0.735Bis贮液：丙烯酰胺28.0克，甲叉双丙烯酰胺0.735克,加重蒸馏水使其溶解然后定容至100mL.30Acr-0.8Bis贮液:Acr30.0克,Bis0.8克,加重蒸馏水使其溶解定容至100mL.以上两种溶液需用棕色试剂瓶盛放,4储存,一般可放置一个月左右.(3)分析纯过硫酸铵(AP)(AR)0.14g加重蒸水100mL,棕色瓶,4储存仅能用一周,最好当天配置.上述三种试剂用于制备分离胶.(4)浓缩胶缓冲液:称取1mol/LHCL48mL,Tris5.98g,TEMED 0.46mL,加重蒸水至80mL,调pH6.7,用重蒸水定容至100mL,棕色瓶4储存.(5)浓缩胶贮液:称取Acr10g，Bis2.5g，加重蒸水溶解定容100mL，过滤后至棕色瓶4贮存。(6)40蔗糖溶液（W/V）(7)核黄素4.0mg,加重蒸水溶解,定容至100mL,棕色瓶4贮存.以上(4)-(7)4种溶液用于配置浓缩胶.3.Tris-甘氨酸电极缓冲液(pH8.3)称取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水至900mL,调pH之后定容至1000mL,4贮存,使用前稀释10倍.4. 0.1溴酚蓝指示剂.5.染色液染色液种类较多,染色方法也不完全相同,详细染色法如下:方法固定染液染色时间脱色氨基黑-10B甲醇7乙酸0.1mol/LNaOH中1氨基黑7乙酸中0.5-1氨基黑5 min(室温)2h(室温)/10min(96)5乙醇7乙酸考马斯亮蓝R25020磺基水杨酸10三氯乙酸0.25R250水液10三氯乙酸-10R250 19:1(体积比)5磺基水杨酸和1 R250 19:1(体积比)5min(室温)30min室温)1h(室温)7乙酸10三氯乙酸90甲酸考马斯亮蓝G2506乙酸12.5三氯乙酸6乙酸中1G25012.5三氯乙酸中0.1G25010min室温)30min室温)甲醇-水-浓氨64:63:1Ponceau 3R12.5三氯乙酸0.1mol/LNaOH中0.13R2min室温5乙醇固绿7乙酸7乙酸中1固绿2h(5)7乙酸氨基萘酚磺酸2mol/L HCL浸几秒钟0.1mol/L磷酸盐缓冲液pH6.8中0.003染料3min本实验采用0.05考马斯亮蓝R250染色液中,含20磺基水杨酸,其优点是染色固定同时进行,背景易脱色.0.05考马斯亮蓝R250的20磺基水杨酸染液:考马斯亮蓝0.05g,磺基水杨酸20g,加蒸馏水至100mL,过滤后至试剂瓶内保存.6.脱色液0.1mol/lNaCl溶液7.保存液甘油10mL,冰乙酸7mL,加蒸馏水至100mL8.1琼脂糖溶液琼脂1g,加已稀释10倍的电极缓冲液,加热溶解,4贮存备用，使用时取出加热成液体，待稍微冷却后用胶头滴管吸取使用，胶头滴管使用完后立即清洗干净.实验仪器夹心式垂直板电泳槽，样品槽模板，直流稳压电源（电压300600V，电流50100mA），吸量管（1mL，5mL，10mL），烧杯，细长头滴管，1mL注射器及6号长针头，微量注射器，水泵或油泵，真空干燥器，培养皿（直径120mm），玻璃板，日光灯一台实验步骤一、 安装夹心式垂直板电泳槽夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，其装置如图 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 1.样品槽模板 2.长玻璃板4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 3.短玻璃板 4.凹形橡胶框 7.冷凝系统 各部件依下列顺序组装:(1) 装上贮槽和固定螺丝，勿使上下贮槽在外连通，使用橡皮管时用夹子夹住.(2) 玻璃板洗净后用吹风机吹干，清洗玻璃板时不得用刷子刷，可用纱布或海绵擦洗，以免在玻璃表面上留下刮痕，清洗后不得用纸或布擦干，将长短玻璃板分别插在硅相框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。(3) 将已插好玻璃板的橡胶框平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。(4) 将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线方式旋紧螺丝帽。(5) 竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅模框交界的缝隙内加入已融化的1琼脂，其目的是封住空隙，凝固后的琼脂应避免里面有气泡。二、配胶目前用于PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶贮液有30Acr-0.8Bis及28Acr-0.735Bis 2种，以它们为母液可以配置不同浓度的分离胶。不同浓度的分离胶及浓缩胶配置方法见下表：试剂名称用量/mL20mLPAA终浓度20mLPAA终浓度分离胶5.57.010.05.07.510.0(1)分离胶缓冲液pH8.9Tris-HCl(TEMED)2.502.502.502.502.502.50(2)凝胶贮液A.28Acr-0.735Bis3.935.007.14B.30Acr-0.8Bis3.335.007.14重蒸馏水3.572.500.364.172.500.83充分混匀后，置于真空干燥器中，抽气10分钟（3）0.14AP101010101010浓缩胶(4)浓缩胶缓冲液pH6.7Tris-HCl(TEMED)2.5PAA13.75PAA1（5）浓缩胶贮液10Acr-2.5Bis23（6）40蔗糖43充分混匀后，置于真空干燥器中，抽气10分钟（7）0.004核黄素11三、制备凝胶板PAGE有连续体系和不连续体系，其灌胶方式不完全相同，分别叙述如下：a) 连续体系 本实验采用28Acr-0.735Bis 凝胶贮液，从冰箱取出各种贮液，平衡至室温后，按上表的配比配制20mL 7.0凝胶。前三种溶液混合在一小烧杯内，（3）号液单独放置一小烧杯。二者抽气后混合均匀，立即用细长头滴管将分离胶溶液加到凝胶膜长、短玻璃板间的夹缝内，当加至距离短玻璃板上缘约0.5cm时，停止加胶，轻轻将样品槽模板（梳子）插入。在上、下贮槽中倒入蒸馏水，液面不能超过上贮槽的短玻璃板，防止蒸馏水进入凝胶之中。作用是增加压力，防止凝胶渗漏。凝胶液在混合后15min开始聚合，约30min-1h完成聚合作用。聚合后，在样品槽模板梳齿下缘与凝胶界面间有折射率不同的透明带。看到透明带后继续放置半小时，再用双手取出样品槽模板，动作要轻，用力均匀，以防弄破加样凹槽。凹槽中残留液体可用窄滤纸条轻轻吸取，切勿插进凝胶中，应保持加样槽凹面平整。放掉上、下贮槽中的蒸馏水，在上下两个电极槽倒入电极缓冲液，液面应没过短玻璃板上方约0.5cm。b) 不连续体系不连续体系采用不同孔径及pH的分离胶与浓缩胶，凝胶制备分两步进行。i. 分离胶制备：根据实验要求，本实验需20mL pH8.9 7.0PAA溶液，配置方法见凝胶配置表。其加胶方式不同于连续体系。混合后的凝胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板的狭缝内，加至距离样品模板梳齿下端约1cm。用1mL注射器在凝胶表面轻轻加一层重蒸馏水,用于隔绝空气,使胶面平整,为防止渗漏,在上、下贮槽中加入略低于胶面的蒸馏水，上下槽两侧加入25oC30oC温水，有助于凝胶。约30min-60min凝胶完全聚合，可以看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线，用滤纸吸去多余的水，但不要碰破胶面。ii. 浓缩胶的制备：浓缩胶为3.75PAA，其配制方法见凝胶配置表。即（4）（5）（6）（7）=1331。混合均匀后用细长头的滴管将凝胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内（即分离胶上方），距短玻璃板上端0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。在上、下贮槽中加入蒸馏水，但是不能超过短玻璃板上缘。在距电极槽10cm处用日光灯或者太阳光照射，进行光聚合，但是不要造成大的升温。凝胶由淡黄透明变成乳白色，则表示聚合作用开始。继续光照，使凝胶完全聚合，聚合完成后放置30-60min，轻轻取出样品槽模板，用窄滤纸条吸去凹槽中多余的液体，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm，即可加样。注：本次试验采用不连续体系，以达到较好的分离效果四、加样用微量注射器取5微升样品，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。五、电泳将直流稳压电泳仪的正极与下槽相连，负极与上槽连接。接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离胶时，将电流调至20-30mA，当蓝色染料迁移至距离橡胶框下端1cm时，电泳完成。关闭冷却水开关及电源。收集上、下贮槽电极缓冲液，取出硅胶框，用钢铲轻轻将一块玻璃撬开移走，将凝胶板置于大培养皿中染色。六、染色本实验用0.05考马斯亮蓝R250染色液，染色与固定同时进行，染色时加热，染色30min左右。七、 脱色用0.1mol/L的NaCl浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去，但注意不要过久，能看清楚蛋白质带即可。注意事项1.器材不洁净会影响凝胶聚合，所有器材均应严格清洗。玻璃板应浸泡在重铬酸钾洗液3-4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水冲洗，再用纱布或海绵蘸洗涤液洗净，最后用蒸馏水冲洗干净，直接阴干或者用吹风吹干。2.用琼脂封底和灌胶时不能出现气泡，以免影响电泳时电流的通过。3.取出样品槽模板以及用滤纸吸取多余液体时应注意不能弄破胶面，动作要轻，用力要均匀。4.电泳时正负极不能接错。思考题1. 为什么要在样品中加入含少许溴酚蓝的40蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝的用途各是什么？2. 上、下电极缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？3. 根据实验过程的体会，总结做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的关键步骤有哪些？评分标准1.按时上课：+5；2.实验台卫生：+10；3.实验操作：+25；4.预习报告：+10；5.实验报告：实验现象、图样描述（+15）；思考题的分析解答（+20）；实验心得（+5）（自评、互评）；实验日志（+10）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白(选学)【目的和要求】1.掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。2.学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，包括制胶、灌胶、加样、电泳、剥胶、染色及脱色等。3.了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用，利用盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质和血清球蛋白-血清清蛋白-铁氧还原蛋白的混合液。【实验原理】盘状聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量的交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。改变单体的浓度或单体与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，将次凝胶灌装于直立的玻璃管中，再加样品，进行电泳分离，称为盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳。一般常采用7.5%的盘状聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，2.4%的分离核酸。盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳又常分为两大类，第一类是连续的凝胶电泳，第二类是不连续的凝胶电泳不连续的凝胶电泳亦可称为盘状电泳。在这种电泳过程中，除去一般的电荷效应外，还有两种物理效应：（1）凝胶对样品分子的筛选效应：颗粒小，形状为圆球形的样品分子，移动较快；颗粒大形状不规则的样品分子，通过凝胶孔洞时受到的阻力较大，移动较慢。（2）不连续系统对样品的浓缩效应：高度的浓缩效应，大大提高电泳分离的分辨率，特别适用于稀浓度的样品的分离。【实验试剂与仪器】试剂：新鲜不溶血的动物细胞，凝胶缓冲液（pH=8.9），分离胶缓冲液（28%Acr-0.735%Bis），浓缩胶缓冲液（pH=6.7），浓缩胶贮液，过硫酸铵溶液（当天用当天配置），核黄素铵溶液，40%蔗糖溶液，Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH=8.3），0.1%溴酚蓝指示剂，染色液，脱色液。仪器：常压电泳仪；圆盘电泳槽；玻璃管（内径约0.5cm0.7cm，长度约8 cm10cm）；有机玻璃架（或自制木头架）；微量进样（100l）器；5ml注射器；长、短注射针头；长、短颈滴管；日光灯或100w白炽灯；乳胶管；玻璃球（或小段玻璃棒）；培养皿；烧杯；洗耳球。【实验步骤】1. 安装圆形玻管2. 取玻璃管洗净烘干后将其下端口用parafilm三层或橡胶玻璃头封严，然后垂直安装在试管架上备用，或直接插于电泳槽内。配胶分离胶的配置比例为pH8.9的分离胶缓冲液2.50ml，28%凝胶贮液5.00ml，重蒸馏水2.50ml，0.14%AP10ml。加AP前需要充分混匀，放置与真空干燥器中抽气10min。分离胶的终浓度为7%，终体积为8ml。浓缩胶的配法：取浓缩胶缓冲液（pH6.7）1ml，浓缩胶贮液2ml，40%的蔗糖4ml，0.004%核黄素铵溶液1ml，加核黄素溶液前需要充分混匀，放置与真空干燥器中抽气10min。所配浓缩胶浓度为2.5%，终体积为8ml。3. 灌胶不连续体系凝胶的灌注分两步。分离胶的制备：混合好的凝胶溶液用细长头滴管加至准备好的玻璃管内，加胶高度距上端口2cm左右，用1ml注射器在凝胶表面轻轻加一层重蒸馏水（沿管壁），约35mm，用于隔绝空气，使胶面平整。3060min后凝胶完全聚合，此时可见水与凝胶面有折射率不同的界线出现。用滤纸条吸去多余水分，勿碰胶面。浓缩胶的制备：混合好的凝胶溶液用细长头的滴管加到分离胶的上面，使其液面距上端约0.5cm，然后置于日光灯（约10cm远）或阳光下照射进行光聚合。注意温度不能太高，凝胶由淡黄色变为乳白色表明聚合作用开始，继续光照半小时，聚合即可完成。然后继续放置3060min，用滤纸条吸去多余水分。4. 加样，电泳将制备好的凝胶玻璃管插入圆盘电泳槽上，加少量电极缓冲液检查一下是否有渗漏现象，若有解决之。然后在上下极槽内加入适量的电极缓冲液，使上下极电路畅通，然后加血清蛋白样液510ul，加样时用微量注射器将样液通过缓冲液小心的加在凝胶表面，将所有玻璃管内均加完样品后即可开始电泳。按照上槽接负极，下槽接正极的方式接在直流稳压电泳仪上，开始电泳，电流约1mA/管，当样品进入分离胶时，将电流调到3mA/管。当染料移至距下端1cm时，将电流调回至零，关电源。分别收集上下极槽电泳缓冲液，4 保存，还可再用。 5. 固定染色取出玻璃管，用注射器吸满自来水后将长针头插到凝胶与管壁之间，推动注射器，同时转动玻璃管，使针头在管壁与胶之间前进，胶条在水的压力及滑润作用下自玻璃管中脱出。然后将干净的胶条浸泡在染色液中，染色10min，同时也进行了固定。6脱色用水冲去胶条表面染料，置于脱色剂中浸泡漂洗，更换漂洗液数次，直到背景色脱去。【主意事项】1、贮液放冰箱中一般可保持12个月，但3号贮液只能保存一周。如有不溶物可过滤。 2、Acr和Bis对神经系统有毒害，使用时要小心，注意勿与皮肤接触。但聚合后的凝胶对人体无害。 3、电泳时的电流最好不超过5mA/管，以免产生过多热量。室温高时应进行冷却或冷库内进行电泳。 4、本实验需时间较长。在一次实验中可安排到脱色一步，再于下一次实验中观察脱色后的胶条并绘图。 5、在碱性条件下，凝胶易聚合，其聚合速度与Ap浓度平方根成正比，一般在室温下，pH8.8时，7.5%丙烯酰胺溶液30min完成聚合作用，在pH4.3时聚合速度很低，约需90min才能聚合，此外应选择高纯度的Acr和Bis。杂质。某些金属离子、低温和氧分子能延长或阻止碳链的延长与聚合作用。【思考问题】1. 影响聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验结果的因素有哪些？2. 聚丙烯酰胺凝胶不聚合的主要原因是什么？如何克服？3. 为什么要在样品中加少许溴酚蓝和一定浓度的甘油 ？