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细胞破碎1 常用的细胞破碎的方法有哪些？机械法，酶法，化学法，物理法2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等3 酶法破碎细胞原理酶分解作用4 反复冻融法破碎细胞原理通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用层析技术1.什么叫层析技术？常用的层析技术有哪些？层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。常用技术有分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析，吸附层析2.指出常用层析技术的应用范围。凝胶层析法：脱盐；用于分离提纯；测定高分子物质的分子量；高分子溶液的浓缩离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子高效液相层析法：液-固吸附层析；液-液分配层析；离子交换层析3SephadexG-100凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么？大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用4.用Sephadex G25脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰？ 蛋白质5.相对分子量为8万和10万的蛋白质能否在SephadexG-75柱中分开？为什么？不能,分子量差距太小6.将分子量分别为a（90 000）、b（45 000）、c（110 000）的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析，正常情况下，将它们按被洗脱下来的先后排序。 c、a、b7.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高？ 离子交换层析较高。8.离子交换层析的原理？根据自交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离主要依赖电荷间的相互作用,利用带电分子中电荷的微小的差异进行分离9.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6.0,His pI=7.6)，在pH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM（阳离子交换剂）结合的紧密？如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？Ala10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？用水灌注、不能有气泡11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则 阴离子交换剂选用阳离子缓冲液（如氨基乙酸、铵盐、Tris等），阳离子交换剂选用阴离子缓冲液（如乙酸盐、磷酸盐等），以防缓冲离子参与交换过程，降低交换剂的交换容量。缓冲液pH值的选择要使被分离物质的电荷与平衡离子电荷的正负性相同。选用的缓冲系统对分离过程无干扰。要确定一定的离子强度。电泳原理1.常见的凝胶电泳有哪几种？说明其主要用途，并比较其主要优缺点。A醋酸纤维素薄膜电泳。用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中。优点是操作简单、快速、廉价缺点是它的分辨力不够高。（比聚丙酰胺凝胶电泳低）B凝胶电泳。用于分子生物学、遗传学和生物化学，如大的DNA或者RNA分子的分离，酶谱法等。优点是操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。C等电聚焦电泳。应用蛋白质和两性分子的分离等。两性优点是分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定蛋白或多肽的等电点。缺点是需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白。2.从分离原理和实际应用两方面简单说明SDS-PAGE和PAGE技术方法有何主要区别？非变性凝胶电泳，也称为天然凝胶电泳，与变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：A. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性凝胶的有SDS。B. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有SDS，也没有巯基乙醇。C.在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。D.非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正极泳动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。 5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在0-4度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。这点跟变性电泳也不一样。所以与SDS-PAGE电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率3.影响蛋白质电泳分辨率的主要因素有哪些？系统的pH值；.电场强度；.温度；电渗作用4.聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白时，使用的电泳缓冲液PH8.3，那么样品应点在哪端？为什么？在负极。因为电泳缓冲液PH8.3时，血清蛋白的几种蛋白电离后都带上负电荷，所有只有点样在负极端，外加电压后，才能向正极移动，彼此才能分开。（PH值大于等电点时带负电荷 ,小于等电点时带正电）蛋白质含量测定1 紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？紫外吸收法优点：简单快速，灵敏度高。缺点：核酸干扰2 若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？校正:计算待测蛋白质溶液的OD280/OD260比值后，查(紫外分光光度法测定蛋白质含量校正数据表）校正因子“F”值，根据经验公式-蛋白质浓度(mg/ml)=F1/dOD280D计算该溶液的蛋白质浓度；D-溶液的稀释倍数，d比色杯的厚度（cm）3 试说明考马斯亮蓝G250法的优缺点。考马斯亮蓝G250 当该染料与蛋白质结合后为青色 ，在波长595nm有最大吸收；其吸收值与蛋白质含量成正比。灵敏度高（0-1000 g/mL ），是常用的微量蛋白质快速测定法。缺点：、大量的去污剂如TritonX-100，SDS等严重干扰测定。B、蛋白质与改染料2min反应达平衡，其结合 物在室温下1h内稳定。时间太长，结果偏低。离心技术1.相对离心力为30，000g，转头平均半径为10cm,求转速r/min （rpm）? （两种方法） 2.制备离心机有哪几种类型？比较它们的特点和用途。A普通离心机；特点型号很多，容量不同，转速不同，控制不精密；用途固液沉淀分离。B高速离心机；特点型号较多，转速不同，有控温装置，控制精密（时间、转速），用途菌体、细胞碎片、细胞器等的分离。C超速离心机；特点控制精密：时间控制、温度控制、转速控制、真空系统；细胞器分级分离、病毒、DNA、RNA、蛋白质分离提纯等。3.在离心场中物质沉降的速度与哪些因子有关颗粒的沉降速度不仅与离心力有关，而且与颗粒大小、密度以及介质黏度有关。4.差速区带离心法和等密度离心法的区别是什么？差速区带离心法：根据分离样品颗粒的不同沉降速度而分层；等密度区带离心法：根据微粒的不同密度而分层。5.常用密度梯度的材料有哪些？糖类（蔗糖）、无机盐（氯化铯）、硅溶胶（Ludox）、有机碘化物。6.几种离心技术的特点？A沉淀离心：选定一定的时间、速度进行离心，使样品液中的大的固型物与液体分离，从而获得沉淀或上清夜。又称为固液分离法。使用普通离心机。B差速分级离心：在均匀介质中，利用各种物质粒子沉降速度的不同而分批分离的方法。C区带离心法：利用各种粒子的沉降速度和浮力密度差异，当一定粒子到达与其密度相同的梯度位置时则停止沉降，不同粒子处于不同位置，则得到了分离。沉淀技术1 蛋白质沉淀的常用方法有哪些盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法2什么是盐析，盐析的原理，列举盐析时常用的盐一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。原理：蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。在某一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到彼此分离的目的。主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠3简述等电点沉淀及原理通过调节溶液的pH值至某种溶质的等电点(pI)时，使其溶解度降低，沉淀析出，而与其他组分分离的方法称为 等电点沉淀法。原理：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤。4什么是有机溶剂沉淀，列举常用的有机溶剂利用要分离物质与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使某种溶质沉淀析出，从而与其他组分分离的方法称为有机溶剂沉淀法。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。酶的提取纯化与活力测定1. 某酶在一定条件下，5 min内使30 mmol底物转变为产物，问该酶的活力（IU）是多少？（每分钟能催化 1 mmol 底物转化成产物所需要的酶量定义为1个国际单位 (IU)）2. 从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，总活力为288单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？比活力=酶活力单位数/酶蛋白质量纯化倍数 =纯化后的比活力 / 粗抽提液比活力产率(回收率) =纯化后的总活力单位 / 粗抽提液总活力单位3.简述酶分离纯化的基本过程A抽提：破碎细胞，动植物组织一般可用组织捣碎器；或者加石英砂研磨，将材料做成丙酮粉或进行冰冻融解 ；对细菌，常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎。 B浓缩：（常用的浓缩方法）加中性盐或冷乙醇沉淀后再溶解，胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。C纯化：利用各种分离方法（盐析法、有机溶剂沉淀法、层析纯化法、等电点法吸附分离法）进行纯化。D结晶：浓缩液经过各种方法的纯化，可得到较纯的结晶产品。4 酶的制备及提取过程中应注意哪些事项5 常用的酶活力单位？U（指在特定条件（25，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量）、Kat（在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量）。1 Kat=6107U， 1U=16.67n Kat6 比活力概念及意义比活力用每毫克蛋白所含的酶活力单位数表示。比活力=酶活力单位数/酶蛋白质量酶的比活力比活力代表酶制剂的纯度。对于同一种酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。蛋白质电泳1.简述醋酸纤维薄膜电泳分离人血清蛋白基本原理。醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。带电颗粒在电场力作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之，则向正极移动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。2.PAGE是现代生物科学研究中主要用来分离分析蛋白质、酶等生物大分子的核心技术之一，该技术分辨率较高的主要因素有哪几种？简要说明。A.聚丙烯酰胺凝胶是一种透明而不溶于水的韧性凝胶，其在电泳中除了具有电泳的分离外，还具有分子筛的作用，故而提高了分辨率B聚合物分子中含有许多酰胺基，所以凝胶具有良好的亲水性，能在水中溶胀但不溶解。.3.简要说明SDS-PAGE技术方法原理及在科研中的应用？原理：仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质应用：蛋白质纯度分析、蛋白质浓度测定、蛋白质水解分析、蛋白质修饰的鉴定、显示小分子多肽。4.影响电泳分离效果的主要因素有哪些？电泳介质PH、缓冲溶液的离子强度、电场强度的影响、电渗、支持物选择、电压5.浓缩效应：在进行SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）中由于凝胶孔径的不连续性（2种孔径）、缓冲液离子成分的不连续性(2种缓冲体系)、PH值（3种PH）和电位梯度的不连续性使得蛋白质分子在浓缩胶和分离胶的界面处浓缩成一条狭小的缝带，成为浓缩效应。6.电泳技术涉及其主要仪器或设备有哪些？电泳槽、烘干机7.醋酸纤维薄膜电泳分离人血清实验方法中，透明液成分是什么？透明液：95%乙醇80ml，冰醋酸20ml混合。8.醋酸纤维薄膜电泳分离人血清实验方法中，染色液成分是什么？染色液：氨基黑10B0.5g 甲醇50ml 冰醋酸15ml 蒸馏水40ml 混匀9.醋酸纤维薄膜电泳分离人血清实验方法中，漂洗液成分是什么？漂洗液：95%乙醇4.5ml，冰醋酸 5ml，蒸馏水50ml混合。10. 醋酸纤维薄膜电泳分离人血清实验方法中，电压正常范围是多大？电压过大会造成什么样的结果？电泳电压的大小，时间的长短与缓冲液的离子强度都有一定的关系。一般电流约0.40.6mA/cm，电压110160V，通电时间4060min。电压高，电流大，电泳速度加快，时间缩短，但薄膜上蒸发严重，因此不能无限增大电流。维生素C的测定1.指出本实验采用的定量测定维生素C的方法有何优缺点？优点：简便易行，快速，比较准确。 缺点：易受其它还原物质干扰，滴定终点难以确定。2. 2,6-D的作用是什么？A.氧化剂的作用。还原抗坏血酸。B作为指示剂，判断滴定终点，以计算样品含量3.滴定管的使用洗涤、装液、计数、滴定纸层析分离氨基酸1为什么苯丙氨酸的Rf值大于赖氨酸因为水与滤纸的吸附性很强，故扩散的慢，邮寄溶剂与滤纸吸附性差，故扩散的快。苯丙氨酸是非极性氨基酸，其易随着有机溶剂一起扩散，而赖氨酸正好相反。故最后苯丙氨酸走的更远些，因而使苯丙氨酸Rf较大些。2为什么脯氨酸和茚三酮加热后是黄色斑点脯氨酸等伯胺氨基酸与茚三酮反应可生成黄色化合物。3说明纸层析和离子交换层析分离氨基酸混合物的方法是根据氨基酸的什么性质?4纸层析和柱层析的一般操作步骤纸层析：点样、层析、标记前沿、烘干、显色、得到层析图谱、标记色斑柱层析：装柱、平衡、上样、洗脱、收集、检测、测定双缩脲法测蛋白质含量1 双缩脲法定量测生物材料中蛋白质是否适合所有样品，如植物块茎等不是。在生物实验中，双缩脲是用来测蛋白质的，现在是出现紫红色。选材时要注意蛋白质含量要高，材料颜色为白色或接近白色。故并非适用所有样品。2.比色测定时为什么要设计空白管？通过溶液的光主要被吸光物质吸收，但同时溶液、溶剂及比色杯对光也有少量的吸收和反射，从而引起误差，此时，测定时常采用空白试验做参比。3.比值法双缩脲法定量测定蛋白质含量的优缺点？优点：快速，蛋白质特异性影响小。缺点：准确度差，蛋白质样品被破坏，干扰因素不易排除。淀粉酶活力的测定1如何正确绘制和使用标准曲线?在制备标准曲线时，标准液浓度一般可选择5种浓度梯度，测其吸光值，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线，需要至少有三个点标准曲线才可用，绘制好的标准曲线只能供以后相同条件下操作测定相同物质时使用。2.淀粉酶原液和1%的淀粉溶液置于40水浴中保温的作用酶反应需要适宜的温度。只有在一定的温度条件下才表现出最大活性。40C是淀粉酶的最适温度，所以将酶液和底物先分别保温至最适温度，然后再进行酶反应，这样才能使测得的数据更准确。3.3,5二硝基水杨酸作用：提供碱性环境，使酶失去活性；做氧化剂，与还原糖反应，起到显色作用。4.淀粉酶的最适温度为40C，最适PH为5.6.5.如何操作能减小标准曲线结果误差？A：标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低和最高指，一般选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。B标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读23次，求其平均值，以减少仪器不稳定而造成的误差。
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